北美H7亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

本研究通过分析NCBI数据库中H7亚型禽流感病毒HA基因序列,根据该基因设计引物,建立了针对北美H7亚型禽流感病毒HA基因的一步法RT-PCR检测方法,并对反应条件进行了优化。该方法可特异地检出北美H7亚型禽流感病毒HA基因,而未检出欧亚分支H7亚型禽流感病毒H7N2和H7N9、其他亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H5N8和H9N2),以及新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒;检测方法的灵敏度可达0.1 pg/μL。该检测方法的建立为监测北美H7亚型禽流感病毒提供了良好的技术支撑,可用于外来禽流感病毒的检测。     

北美H7亚型禽流感病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

H7N9亚型禽流感病毒(AIV)对家禽养殖业和公共卫生的持续威胁提示我们应加强对H7亚型流感病毒的监测。根据血凝素(HA)基因的分子遗传进化特点,H7亚型AIV分为欧亚和北美两个进化分支,我国自然分离到的H7亚型AIV均属于欧亚分支,但是目前我国尚未检测到北美H7亚型AIV。本研究通过分析NCBI数据库中H7亚型AIV HA基因序列,设计特异性引物,建立了针对北美H7亚型AIV HA基因的实时荧光定量PCR检测方法。该方法仅针对北美分支H7亚型AIV HA基因出现特异性扩增曲线,不能检出欧亚分支H7亚型AIV、其他亚型(H3、H5和H9)流感病毒以及新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒;检测方法的灵敏度可达53 Copies/μL。该检测方法的建立为监测北美H7亚型AIV提供了良好的技术支撑,可用于外来AIV的监测。     

H5N8亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

流感病毒变异迅速,为研究和建立一种针对H5 N8亚型流感病毒核酸准确灵敏的检测方法,分别选择H5 N8亚型流感毒株序列相对保守的HA基因和NA基因作为H5 N8亚型流感病毒检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,选择两种不同的荧光标记,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5 N8亚型禽流感病毒检测方法。实验结果表明,所建立的H5 N8亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10-5,NA基因检测的灵敏度为10-5,重复性好,特异性佳。结果表明:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5 N8亚型流感病毒,耗时短,可很快作出判定结果,适用于H5 N8流感病毒的分子生物学检测和监测。对于控制流感流行,减少经济损失,最大限度保护社会人群健康具有很大意义。     

双重RT-PCR快速检测H7N9流感病毒方法的建立

为建立简便快速检测H7N9亚型流感病毒的方法,根椐GenBank中H7亚型流感病毒的HA基因序列和N9亚型流感病毒的NA基因序列,设计2对特异性引物,在建立H7亚型和N9亚型单项RT-PCR的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立同时检测H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR。对H7N9亚型流感病毒核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增HA基因263bp、NA基因520 bp的特异性片段,而对其他常见亚型的流感病毒的RT-PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR方法的检测下限为3 pg的H7N9病毒模板。利用该双重RT-PCR方法对30份临床样品进行H7N9病毒进行检测,与病毒分离方法进行对比,结果显示,两者的符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7N9流感病毒的同时检测和鉴别诊断,为H7N9亚型流感的有效防控提供技术支撑。     

H7和N9亚型及A型流感病毒多重荧光定量RT-RCR检测方法的建立

为同时检测H7亚型、N9亚型和A型流感病毒,本研究根据流感病毒H7 HA、N9 NA以及M基因序列分别合成3对引物和3种荧光素标记的探针,建立了多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法.特异性试验结果显示,仅H7亚型和N9亚型病毒分别在FAM和JOE通道监测到荧光信号,而所有A型参考流感病毒株均可获得Cy5荧光信号,此外其他相关的禽源病毒检测结果均为阴性.同时,以H7N9亚型病毒RNA为模板建立了标准曲线,检测H7 HA、N9 NA以及M基因的R2值均为0.999,最低检出量均为35.4 EID50/mL.批内和批间试验的变异系数均小于1.48％.利用该方法对1 072份临床样品(咽喉和泄殖腔拭子)检测,H7N9亚型和A型流感病毒分别检出7份和23份.该方法可以有助于H7N9亚型和A型流感病毒的快速检测及鉴定.     

广西1株H3N8型马流感病毒的分离与鉴定

对具有流感临床症状的病马组织经处理后接种SPF鸡胚,分离到1株流感病毒。该病毒经鸡胚接种7代后,出现稳定的对鸡红细胞凝集效价,效价为25,能被H3亚型血清中和,与H1、H5、H7、H9亚型阳性血清无交叉反应;对HA基因及NA基因进行序列分析,结果显示:HA基因与马流感病毒H3亚型同源性最高,NA基因与马流感病毒N8亚型同源性最高,判断该病毒属于H3N8亚型马流感病毒,命名A/EQ/Guangxi/01/09。     

一株H3N2亚型犬流感病毒的分离鉴定

从北京市延庆区某疑似发生犬流感的德国牧羊犬采集犬鼻拭子,采用鸡胚接种、传代、HI试验、HA和NA基因扩增和序列同源性分析及比格犬回归试验等方法对病毒进行分离鉴定。结果表明,分离的病毒具有HA活性,且HA活性可被H3亚型禽流感病毒阳性血清所抑制(HI抗体效价为1∶160),与H1、H5、H7亚型禽流感病毒阳性血清和犬流感阴性血清HI试验均为阴性反应(HI抗体效价1∶10)。分离病毒HA基因、NA基因与A/canine/Georgia/89750.1/2017(H3N2)毒株HA、NA基因的同源性均为99.8%。攻毒后第4天开始,2只犬均出现体温升高、咳嗽、流鼻和精神沉郁等临床症状,并从鼻拭子中分离到病毒,该病毒是一株H3N2亚型的犬流感病毒,将其命名为A/canine/China/Huabei-170607/2017(H3N2)。     

H5N6亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为研制H5N6亚型流感病毒核酸快速检测试剂盒,选择H5N6亚型流感毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5N6亚型禽流感病毒的方法。实验结果表明,所建立的H5N6亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10~(-5),NA基因检测的灵敏度为10~(-4),重复性良好,特异性佳。结论:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5N6亚型流感病毒。     

2017年冬季上海地区犬流感病毒的检测与HA、NA序列的遗传进化分析

为了解2017年冬季上海临床接诊犬的流感病毒感染情况和病毒变异趋势,收集上海某动物医院疑似犬流感样品进行RT-PCR检测,构建HA、NA的重组载体并测序,对获得的序列进行进化分析、氨基酸变异分析,综合我国同亚型犬流感病毒HA序列进行进化率分析。结果显示:23份疑似样品中检出5份阳性样品,获得5个H3亚型的HA序列、2个N2亚型的NA序列,上述序列在进化树中已经形成独立的进化分支,与韩国、广东毒株亲缘关系最近;氨基酸比对表明,HA和NA在重要位点发生许多一致的突变,如抗原位点区域、糖基化位点等,NA茎部未见氨基酸插入;对2007年至2017年中国南方地区分离的H3N2犬流感病毒HA片段进行进化率、变异率分析显示,年平均进化率呈逐年增高趋势,变异不断积累。研究表明,开展犬流感病毒变异监测,掌握病毒变异和进化方向,对防控该病、防止病毒向人群传播有重要意义。     

马流感病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上马流感病毒H3N8 HA和NA的基因序列,设计并合成了扩增HA和NA基因RT-PCR引物及NA基因荧光定量RT-PCR引物探针,经条件优化,建立的HA和NA RT-PCR方法检测下限为10 TCID50;荧光PCR方法检测下限为0.1 TCID50。对H5、H7、H9、H3N1、H3N2、Pi等6种病毒核酸进行扩增,发现具有良好的特异性,显示建立的方法具有高效、快速、特异、灵敏的特点,可用于马流感病毒的检测和监控。