广西地区一株新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及σC基因遗传进化分析

为了解广西地区新型鸭呼肠孤病毒(novel Duck reovirus, NDRV)的分子流行病学特征并揭示其遗传变异情况,试验采用RT-PCR方法对某鸭场送检的病料进行病原鉴定,将鉴定为阳性的样品接种于9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔进行病毒的分离,对分离到的毒株的σC基因进行扩增、克隆和测序,并与参考毒株σC基因序列进行比对分析,绘制系统进化树。结果表明：分离到一株NDRV毒株,命名为NDRV-GX株。该分离毒株与NDRV代表毒株高度同源,核苷酸相似性为92.5%～100%,氨基酸相似性为94.2%～100%;而与番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus, MDRV)及禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)分离毒株的核苷酸相似性为26.7%～37.2%,氨基酸相似性为27.8%～38.1%;与MDRV、ARV分离毒株处于进化树的不同分支,而与其他NDRV代表毒株处于同一分支。说明该分离毒株为NDRV,与NDRV代表毒株具有相近的遗传演化关系,同属于基因2型。     

鹅呼肠孤病毒GRV1株分离鉴定及其σC基因特征性分析

从患运动障碍的雏鹅肝脏和脾脏分离到一株鹅源呼肠孤病毒,该病毒经琼脂扩试验可与番鸭呼肠孤病毒(MuscovyDuckReovirus,MDRV)的抗血清发生交叉反应,推测其为呼肠孤病毒,命名为GRV1。参考GenBank禽呼肠孤病毒(AvianReovirus,ARV)和番鸭呼肠孤病毒小外壳蛋白(minorcoreprotein)σC蛋白基因序列设计合成了一对引物,病毒RNA经RT-PCR扩增,产物为810bp,与预期的目的片断大小一致,测序结果表明σC基因在280～1089区间是一个开放性阅读框架,编码269个氨基酸的蛋白,GC含量为49.88%,等电点为6.497,分子量为29.4Ku。核苷酸序列经DNAStar(6.0)软件分析,与法国番鸭呼肠孤病毒89026株核苷酸同源率为93.0%,与鸡呼肠孤病毒σC基因同源率仅为21%～25%,同源性分析表明鹅呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤病毒可能来自同一祖先,建议将鹅呼肠孤病毒连同番鸭呼肠孤病毒归属为正呼肠孤病毒属第二个亚群中不同于禽和内尔森贝海湾呼肠病毒的独立基因群。由蛋白质分析软件Anthepro5.0和MultiCoil软件分析表明,抗原区多位于N末端,没有跨膜区,σC为三股螺旋结构,这是我国第一次在鹅体内分离到呼肠孤病毒,同时也是第一次在数据库中提供σC的序列。     

山东地区新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

为了解山东地区肉鸭呼肠孤病毒的流行情况,从山东地区收集肉鸭坏死脾脏病料,经研磨处理,接种鸭胚,对分离病毒进行PCR扩增和σC基因测序分析。PCR扩增结果显示共分离得到6株病毒,测序结果显示,6株病毒σC基因核苷酸同源性为99.0%～100.0%,与新型呼肠孤病毒毒株核苷酸同源性为93.7%～99.3%。由此确定,分离的6株病毒均为新型呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)。该研究为山东地区NDRV的防控提供一定参考依据。     

新型鸭呼肠孤病毒广东分离株σC蛋白基因序列分析

从广东湛江某肉鸭养殖场发生脚软、关节肿大为临床特征和脾脏肿大、肝脏有坏死灶为病变的樱桃谷鸭病料中分离到一株新型鸭呼肠孤病毒,命名为GD693。对新型鸭呼肠孤病毒GD693株σC蛋白基因进行 RT-PCR 扩增、克隆和测序,并与参考毒株σC蛋白基因序列进行比对分析。结果显示：GD693株与新型呼肠孤病毒（NDRV）代表毒株处于进化树的同一大分支,但却处于一个单独的分支,同属于基因2型,具有相近的遗传演化关系;与NDRV代表毒株091株、TH11 株的σC蛋白基因序列进行比较分析,存在核苷酸和氨基酸的序列改变,毒株有可能发生变异或毒力增强。     

1株新型鸭呼肠孤病毒(SL株)的全基因组测定分析及其致病性

为明确我国川渝地区鸭疑似呼肠孤病毒病的致病原,本试验对患病鸭进行病毒的分离、鉴定、全基因组测序分析及致病性试验。首先针对临床肝脾肿大、出血坏死为主要特征的病例,利用鸭胚传代法进行病毒的分离,结合RT-PCR方法鉴定分离毒株;其次利用二代测序技术对分离毒株进行全基因组测序,利用MEGA X软件对序列进行比对和分析;最后将分离毒接种7日龄健康雏鸭,观察其病死率及肝脏、脾脏组织的病理变化。结果发现F6代病毒能够稳定适应鸭胚,RT-PCR鉴定为呼肠孤病毒,对鸭胚的半数致死量(ELD₅₀)为10^-5.32/0.2 mL,分离毒命名为SL株。全基因测序显示该毒株全长23 580 bp, GC含量49.62%,共分10个节段,分别为L1～L3、M1～M3和S1～S4(GenBank登录号：MW196679～MW196688)。序列分析显示SL株与新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus, NDRV)具有较高的相似性,为87.02%～99.48%;与番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的相似性次之,为80.09%～98.77%;而与鸡源呼肠孤病毒(AR...     

新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及板蓝根合剂的预防效果评价

本研究对采自山东不同地区的疑似鸭呼肠孤病毒感染病料样品进行了病原的分离与鉴定,成功分离出5株鸭呼肠孤病毒,根据鸭呼肠孤病毒σC蛋白的基因序列,利用RT-PCR技术对分离株进行了鉴定。结果表明,分离株σC基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%～99.6%和94.4%～99.7%,与新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）的σC基因的核苷酸同源性为96.9%～98.6%。基于σC基因的遗传进化分析表明5个分离株均符合NDRV的分布特点,且与禽呼肠孤病毒（ARV）和番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的亲缘关系相对较远,均属于新型鸭呼肠孤病毒。进一步对板蓝根合剂的预防效果进行了研究,结果显示,板蓝根合剂药物-攻毒组的发病率显著低于攻毒组。本研究成功分离鉴定出5株NDRV,并发现板蓝根合剂对鸭呼肠孤病毒病具有良好的预防效果,能够有效抵抗NDRV的感染,这为今后新型鸭呼肠孤病毒病的预防提供了新的思路。     

番鸭呼肠孤病毒σB和σNS基因克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,DRV)σB和σNS基因序列设计合成引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB和σNS基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序。结果显示扩增产物分别为1154bp和1113 bp,与预期的目的片段大小一致。核苷酸序列经BLAST软件分析表明：番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB基因与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为88．1%；氨基酸同源性为94．0%：σNS基因与法国89026株和89330株同源性分别为93．8%和93．1%；氨基酸同源性为95．9%和95．1%。而σB和σNS基因与禽呼肠孤病毒的同源性约为60%～80%。表明番鸭呼肠孤病毒是不同于禽呼肠孤病毒的独立基因群。     

鹅源番鸭呼肠孤病毒的分离鉴定

近几年,鹅“白点病”频发。本研究从江苏沛县地区肝脏有坏死点的发病鹅中收集肝脏病料,进行病毒分离,通过RT-PCR检测、序列分析进行病毒鉴定,并回归雏鹅进行致病性试验。结果发现：该毒株在鹅胚上生长良好;回归鹅能完全复制出临床中肝脏出现坏死点的病变,并能从实验鹅中重新分离到该病毒;对其主要抗原基因σC进行测序比对和进化树分析发现,其与番鸭呼肠孤病毒基因序列的进化关系较近,同源性为89.6～98.9%。本研究证实了鹅“白点病”的病原为番鸭呼肠孤病毒,为该病的防控奠定了基础。     

一株新型鸭源呼肠孤病毒(TH11株)的分离与鉴定

本文从太湖流域某养鸭场分离到一株呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)TH11株,该病毒感染的病鸭主要表现软脚和拉稀等主要症状,剖检病变以肝脏出血和脾脏坏死为主要特征。电镜鉴定结果显示,该病原具有呼肠孤病毒的典型形态学特征。动物回归试验和RT-PCR扩增结果证明,该株病毒无论是在致病性方面,还是在基因序列方面都不同于以往的番鸭呼肠孤病毒,而是一株对多品种鸭具有较高致病性和病死率的新型鸭呼肠孤病毒。     

广东新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因克隆及序列分析

为研究广东新型呼肠孤病毒(NDRV)的基因变异及遗传演化情况,本试验从广东不同鸭场病死鸭肝脏、脾脏等组织脏器中分离到8株流行毒株,用RT-PCR方法进行σB蛋白基因扩增、克隆与序列分析,并与其他毒株σB蛋白的氨基酸特性、蛋白抗原和蛋白基因进行系统进化比对分析。结果表明,广东省鸭群中感染的NDRV与国内其他地区报道的DRV核苷酸序列同源性很高,达96.6%~99.5%,而与禽呼肠孤病毒(ARV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的同源性则较低,分别为64.6%~66.5%和66.2%~67.1%;8株NDRV之间的核苷酸序列同源性高达97.7%~99.7%。与其他毒株比较结果显示,本试验分离的NDRV毒株磷酸化位点均比参考毒株ARV和MDRV少,且大多数区域的抗原指数都较高,抗原性与MDRV较为接近,遗传进化分析结果表明,NDRV和国内其他DRV处于独立的进化分支,ARV和MDRV则处于不同分支。结果表明,广东省流行的NDRV毒株σB蛋白基因序列高度保守,且广东地区分离的NDRV与国内其他地区分离的DRV没有明显的地域差异。     

鹅出血性坏死性肝炎的诊断和防控

正鹅出血性坏死性肝炎又称鹅呼肠孤病毒感染,是2001年以来在我国养鹅业出现的一种呼肠孤病毒病。该病主要危害1~10周龄鹅,其特征病变是肝脏兼具出血灶和坏死灶。该病由王永坤首先在江苏发现,此后在全国许多地方的鹅群流行并造成危害。1病原分析该病的病原为鹅呼肠孤病毒,属呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属成员。若按国际病毒分类委员会的分类标准,可认为GRV与禽呼肠孤病毒属同种病毒,并     

1株新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

山东某鸭场疑似发生新型鸭呼肠孤病,从采集的病料组织样品中分离出1株病毒,经一步法RT-PCR扩增得到新型鸭呼肠孤病毒部分S3基因序列,克隆到p MD18-T载体中,经序列测定,与Gen Bank上的毒株序列进行比对,并做了该病毒的致病性试验。结果显示,该分离株与参照的新型鸭呼肠孤病毒同源性为100%,并对鸭具有一定的致病性。本试验成功分离获得1株新型鸭呼肠孤病毒山东地方流行毒株。     

番鸭呼肠孤病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank上发表的鸭呼肠孤病毒基因组序列,利用生物学软件设计合成内外2对引物,建立了检测番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的套式RT-PCR检测方法,并运用建立的检测方法对分离病毒与其他禽病病毒进行检测。结果显示,该方法能从MDRV中扩增到与预期大小相符的特异性目的片段,检测灵敏度达到0.1 pg病毒RNA,对禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)、鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)、鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV)等病毒样品的扩增结果均为阴性。因此,本研究为番鸭呼肠孤病毒病的快速检测及诊断研究提供参考。     

一株肉鸡呼肠孤病毒变异株的分离鉴定

旨在研究肉鸡呼肠孤病毒分离株致病与基因组变异情况。2017年从山东潍坊地区跗关节肿胀、出血严重商品肉鸡中收集病料,进行病毒分离,通过RT-PCR检测、电镜观察对病毒进行鉴定;将分离到的病毒回归商品肉鸡;设计18对引物对分离株全基因组扩增测序,并进行了遗传进化分析;将分离毒株与经典毒株S1133进行血清交叉中和试验。结果表明分离到一株禽呼肠孤病毒(命名为WF17),回归商品肉鸡能完全复制出临床症状,并能从试验鸡中重新分离到该病毒。该分离株基因组完全符合禽呼肠孤病毒基因组结构特点,主要抗原σC蛋白基因与台湾918株最接近,相似性为92.7%,与S1133株的相似性只有55.9%。WF17株与S1133株的抗原相关指数(R值)只有0.19。目前以S1133株为主的商品化疫苗无法对禽呼肠孤病毒变异株产生有效保护。     

新型鸭呼肠孤病毒分离鉴定及其σC基因序列分析

【目的】 了解并掌握新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）流行特点及生物学特性,为NDRV的防治提供理论基础和技术支持。【方法】 采集河北某鸭场疑似发生鸭呼肠孤病毒感染的组织,无菌处理后接种SPF鸡胚分离病毒,收获第3代尿囊液进行血凝试验,通过PCR、透射电镜观察、间接免疫荧光法（IFA）鉴定病毒,对分离得到的病毒进行体外细胞培养和动物回归试验,并采用Mega 7.0对其σC基因进行遗传进化分析。【结果】 分离得到的病毒不能凝集鸡红细胞,可致死鸡胚,死亡鸡胚出血、充血严重;经PCR鉴定,病毒呈NDRV阳性,其他病原（禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、禽腺病毒血清4型）均呈阴性,将分离得到的病毒命名为BD/CHN/2020株;病毒纯化后,经电镜观察可见直径为60~80 nm、无囊膜的球形病毒粒子,该毒株可在BHK和LMH细胞上稳定增殖并产生细胞融合的细胞病变效应（CPE）;IFA结果显示,BD/CHN/2020株接种BHK细胞后在激光共聚焦显微镜下观察可见特异性绿色荧光;BD/CHN/2020株经皮下接种后,发病鸭出现精神沉郁、排白色稀粪等临床症状,剖检可见脾脏出血、肿大、有白色坏死灶等病理变化;序列比对发现,BD/CHN/2020株与NDRV毒株（TH11、091等毒株）在同一分支,与NDRV SY株核苷酸和氨基酸序列相似性最高,均为99.7%,属于NDRV。与灭活疫苗TH11株（KC493571.1）和弱毒疫苗JS01-105P株（V202168）相比,BD/CHN/2020株第93、120、132、158、253、298位氨基酸处发生了位点突变。【结论】 成功分离得到1株NDRV BD/CHN/2020株,分离毒株对北京鸭有较强的致病性,与国内疫苗株相比,BD/CHN/2020株的σC蛋白已经发生了氨基酸位点的突变,结果可为新型鸭呼肠孤病毒病的流行病学及疫苗研发奠定基础。     

禽呼肠弧病毒感染

禽呼肠孤病毒是呼肠孤病毒属成员。最新国际病毒学分类委员会第七次分类报告(2000)将哺乳类呼肠孤病毒(Mammalian orthoreovirus,MRV)、禽类呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)和纳尔逊海湾病毒(Nelson Bay virus,NBV)以及狒狒呼肠孤病毒(Baboon reovirus,BRV)这四个代表种分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个亚群,其中ARV和NRV在亚群Ⅱ内;而两个蛇源分离株因具有亚群Ⅱ     

新型鸭呼肠孤病毒QY株S3基因克隆与序列分析

参考GenBank新型鸭呼肠孤病毒（New-type duck reovirus,NDRV）S3基因序列设计合成一对引物,对新型鸭呼肠孤病毒QY株S3基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序.结果显示扩增产物为1 104 bp,与预期的目的片段大小一致.相似性分析QY株S3基因核苷酸序列与ARV代表株、MDRV代表株和DRV代表株,相似性分别59.4％ ～ 60.0％、61.1％～ 61.3％和96.7％～ 98.6％;氨基酸的相似性分别为67.6％～ 68.7％、68.1％～68.9％和95.4％～ 98.4％.表明QY株的S3基因具有不同于ARV和MDRV的特征,分离病毒QY株是不同于禽呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒的独立基因群.     

一株鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及其致病性研究

为了确诊临床雏鸭"肝脾坏死症"的致病原,试验取患"肝脾坏死症"死亡雏鸭的肝脏和脾脏制备病料滤液,用其接种SPF鸭胚并分离病原,对分离病原进行相关研究。结果表明:病料滤液传至第6代时对鸭胚的有效致死率为94.44%,死亡鸭胚胚体有出血斑点,肝脏和脾脏有坏死灶;病原经RT-PCR扩增确诊为鸭呼肠孤病毒(DRV),基因片段与NCBI中10株水禽呼肠孤病毒比对同源性为95.5%～97.3%,将其命名为鸭呼肠孤病毒JS株;该病毒对氯仿不敏感,对1%鸡红细胞悬液无凝集性,对鸭胚的半数致死量为1×10~(-3.24)ELD_(50)/0.1 mL,对雏鸭的半数感染量为1×10~(-3.49)ID_(50)/mL;人工感染雏鸭5 d后扑杀,取肝脏和脾脏制做病理切片,病理切片显示肝脏和脾脏损伤明显。说明临床雏鸭患"肝脾坏死症"的致病原为鸭呼肠孤病毒,鸭呼肠孤病毒JS株可作为候选毒株用于该病的进一步防控研究。     

一种新型鸭呼肠孤病毒SYBR GreenⅡ荧光定量PCR方法的建立

该研究旨在建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)的荧光定量PCR诊断方法。本实验以感染新型鸭呼肠孤病毒的鸭组织RNA提取物为模板,根据Gen Bank数据库中呼肠孤病毒S1基因全序列,设计合成了一对特异性引物,PCR扩增基因片段,将其克隆至p ET-30a载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立SYBR Green II荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。经测序证实扩增片段与预期目的片段相符,所建立的SYBR Green II荧光定量PCR检测S1的反应在101~108 copies/u L之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10 copies/μL,而H5型禽流感病毒、H9型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、C型鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鹅细小病毒、鸭瘟病毒等病毒的检测为阴性,表明该方法敏感、特异。本研究成功建立了SYBR Green II荧光定量PCR检测新型鸭呼肠孤病毒的方法,为新型鸭呼肠孤病毒致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台。     

山东地区新型鸭呼肠孤病毒致病特点与变异分析

本研究将2011~2018年从山东地区分离到的8株新型鸭呼肠孤病毒进行了毒力和致病性试验,结果显示,8株毒株对鸭胚、鸭胚成纤维细胞、雏鸭的致病性基本一致,鸭胚毒价为10-5.00~10-6.00/0.1 m L,鸭胚成纤维细胞的毒价为10-5.33~10-6.30/0.1 m L;对8株毒株的主要抗原σC蛋白核苷酸和氨基酸序列进行比对分析,结果显示,核苷酸同源性为94.5%~99.6%,氨基酸同源性为95.0%~99.4%;通过绘制遗传进化树发现,与全国其他地区毒株相比,山东地区分离的这8株分离株处于一个独立分支,并且这8株分离株的遗传进化与时间有着密切的相关性,暗示山东地区新型鸭呼肠孤病毒随着时间的推移在不断发生着变异。