猪ALAS1基因的克隆、序列分析及表达模式的研究

目的:首先克隆了猪ALAS1(5-aminolevulinate synthase 1)DNA序列,并对CDS序列进行了序列分析,分析了该基因的表达模式。方法:以4月龄长大母猪的卵巢为材料,运用同源序列克隆技术,对猪ALAS1 DNA序列进行克隆并对其进行生物信息学分析;利用性腺激素处理卵巢颗粒细胞并结合RT-PCR方法分析了猪ALAS1基因的表达模式。结果:克隆得到了猪ALAS1 DNA序列9 137 bp,其中包括53 bp的5'非编码区序列、1 922 bp的CDS序列和2~9内含子序列,共编码640个氨基酸;猪ALAS1蛋白氨基酸序列与人和小鼠的相似性一致(100%);ALAS1蛋白的分子量约为38.0 KDa,等电点为9.07,可能存在10个PKC磷酸化位点、1个CAMP磷酸化位点、4个N-糖基化位点、12个豆蔻酰化位点、3个CKII磷酸化位点和1个酰胺位点,还包含1个天冬酰胺转氨酶超家族(AAT-1)保守结构域;猪ALAS1在性腺激素处理2个卵巢颗粒细胞后,可检测到该基因在卵巢颗粒细胞中的显著性表达,之后其表达量迅速下降,12 h后表达量又提高,之后表达量再次迅速下降。结论:猪ALAS1基因的CDS区在物种间保守性强,推测猪ALAS1基因参与卵泡的发育和排卵及在黄体化过程中发挥一定作用。     

猪ADAR1基因cDNA全长克隆、序列信息及组织表达分析

旨在克隆猪作用于RNA的腺苷脱氨酶1基因(ADAR1)cDNA全长序列,检测该基因在大白猪不同组织及不同日龄背膘中的表达情况。本研究利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)克隆大白猪ADAR1基因mRNA全长序列,并对其进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR方法检测ADAR1在不同组织中的表达水平,并探究不同日龄背膘中ADAR1的表达规律。结果表明,猪ADAR1基因cDNA全长6259bp,编码1145个氨基酸,与人、黑猩猩、猕猴、长臂猿、黄牛、山羊和绵羊的氨基酸序列一致性均不低于85%。该基因编码的蛋白具有2个Zα结合结构域,3个双链RNA结合结构域和1个脱氨酶结构域。ADAR1在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、小肠和背部脂肪组织以及7、60、120和180日龄个体背膘组织中均表达,其表达量总体上表现出随个体发育先下降后上升的趋势。综上所述,本研究成功克隆了猪ADAR1基因cDNA全长序列,发现其在猪体内广泛表达,并且在不同日龄猪背膘组织中表达水平存在差异,为今后深入研究ADAR1的功能奠定了理论基础。     

猪DECR1基因cDNA的克隆、序列分析及原核表达研究

旨在研究猪2,4-dienoyl-CoA reductase1(DECR1)基因的结构,揭示该基因的原核表达规律。试验以山西马身猪的肝脏组织为材料,采用RT-PCR与RACE技术克隆了DECR1基因的cDNA全序列,并将其重组于pET32a+原核表达载体中,经酶切、序列鉴定正确后,重组质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。结果表明:猪DECR1基因的cDNA全长2352bp,包括987bp的开放阅读框(ORF),53bp的5′非翻译区(UTR)和1312bp的3′-UTR;编码区(CDS)编码328个氨基酸残基与猪(电子预测序列)、牛、人、猩猩、猴、马、犬、鼠相应序列的同源性分别为99%、88%、88%、87%、87%、87%、87%和83%;SDS-PAGE电泳结果显示,在IPTG诱导4h时,外源蛋白表达效率最高;Western blot检测发现经诱导表达的蛋白产物大小约为35ku,与预测的大小一致。猪DECR1基因的克隆和表达研究,为进一步探究该基因的生物学功能及其分子遗传机制提供了理论基础。     

猪DDX家族成员基因结构与表达特性分析

为了系统研究DDX解旋酶家族成员在猪生长发育中的作用,试验采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR检验技术,对猪DDX家族的42个成员的基因结构、理化性质、功能结构域、聚类进化树、GO功能,以及在大白猪和马身猪盲肠组织中的表达情况进行了研究。结果表明：猪DDX家族除DDX28和DDX53基因没有内含子外,其他成员均含有外显子和内含子,且外显子平均数量为16个,内含子平均数量为15个。除8号染色体外,其他染色体上均有猪DDX家族成员分布。该家族成员均为疏水蛋白并且大多数不稳定,具有多个亚细胞定位,整体来看主要分布于细胞核中。猪DDX家族成员共预测到了15个保守基序,其中DDX1、DDX11、DDX19B、DDX26、DDX36、DDX39A、DDX58和DDX60基因缺失D-E-A-D保守基序,有10个保守基序出现在超过30个成员的序列中,同时不同成员有相同的基序类型和特定的基序排列顺序。聚类分析将猪DDX家族42个成员分为6大簇,其中DDX2和DDX48、DDX21和DDX50、DDX43和DDX53、DDX5和DDX17具有高度同源性,支持率为100%。该家族大多数成员具有ATP依赖性...     

猪IFN-α1和IFN-β1基因的克隆与序列分析

从猪的肝细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增IFN-α1和IFN-1β基因,分别克隆到PMD18-T载体上。测序结果表明,克隆的IFN-α1核苷酸序列与GenBank上登录的猪IFN-α1核苷酸同源性为100%,与鼠、犬、人和牛IFN-α1基因同源性为71.1%~81.4%。克隆的IFN-1β核苷酸序列与Gen-Bank上登录的猪IFN-β1核苷酸同源性为99.6%,推导的氨基酸同源性为99.5%;与人、牛和马IFN-β1基因同源性为76.9%~80.4%。     

猪PGAM2基因的克隆、序列特征及表达分析

克隆了猪PGAM2基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法进行分析。所得cDNA序列全长913 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码253个氨基酸。序列分析表明,该基因预测编码蛋白与已报道的狗（97.6%）、人（96%）、黑猩猩（96%）、大鼠（94.5）和小鼠（94.1%）等物种的PGAM2蛋白高度同源其在N端和C端分别存在1个ATHR和QGKA模体,在14~15AA处存在1个信号肽切割位点,含有1个典型的碳水化合物运输和代谢（GPMA）保守结构域。该基因在猪胚胎骨骼肌发育过程中差异表达,且在通城猪和长白猪中呈现不同表达模式。在通城猪中,PGAM2基因呈波浪式表达,即妊娠65 d时表达水平最高,且各时间点表达水平差异极显著（P〈0.01）。在长白猪中呈上调表达模式,妊娠65和90 d时表达丰富,且极显著高于妊娠33 d（P〈0.01）。品种间比较来看,在妊娠33和65 d时两品种表达水平相当,但妊娠90 d时长白猪中的表达水平极显著高于通城猪（P=0.006）。     

猪Sar1b基因的分子克隆、序列分析及原核表达

根据GenBank已发表的猪Sar1b基因序列（GenBank登录号：AY819557）设计1对引物,以猪肝脏组织总RNA的反转录产物为扩增模板,用RT-PCR方法扩增出猪Sar1b基因cDNA全长编码区,经过EcoRI-SalI双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-Sar1b重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol/LITPG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为26 ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。猪Sar1b基因的克隆和表达研究,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

猪Ghrelin基因的克隆及原核表达

从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达．     

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。     

猪ESR基因一个外显子片段的克隆与序列分析

参考人、鸡、鼠的ESR基因序列，设计一对引物，采用PCR技术扩增出猪ESR基因一段DNA片段，将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR扩增和酶切分析进行阳性克隆鉴定，然后测定核苷酸序列，并推导其氨基酸序列。将测定的猪ESR基因的部分序列（332bp)与人、鼠、鸡的序列进行比较，结果表明：猪的核苷酸和氨基酸序列与人、鼠、鸡相比，同源性分别为90．06％和86．36％，85．54％和88．18％，74．10％和71．82％，显示了强的保守性，猪的核苷酸序列与人、鼠、鸡相比存在着4处特有变异，氨基酸序列aa25-30存在高变异区。     

猪细小病毒YK株NS1基因的克隆与序列分析

提取猪细小病毒（PPV）YK株基因组DNA，利用PCR技术扩增得到了NS1基因全序列，将其克隆到pMD 18-T质粒载体并进行了序列测定和分析。结果表明，NS1基因全长1989bp，编码662个氨基酸。氨基酸序列中含有在PPV复制过程中起重要作用的保守基序GKRN，并有3个潜在的糖基化位点NISN、NFSN和NLTR。PPV YK株的NSl基因与其他PPV毒株NADL-2（4973）株、NADL-2（5075）株、NADL-2（5034）株和Kresse株相比，核苷酸同源性分别为98．3％、99．9％、99．9％和99．7％，氨基酸同源性分别为99．7％、99．7％、99．7％和97．7％。结果说明，NS1基因具有高度保守性。     

猪EP1基因的克隆与原核表达

为进一步体外研究EP1基因的生物学功能,本试验对EP1基因进行了组织分布分析。以猪骨髓cDNA为模板克隆了猪EP1基因的开放阅读框,对克隆的基因序列进行了序列分析,用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-LIC中。用菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序,将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中。丙酸钠诱导表达His6-MBP-EP1融合蛋白,并用Western blot进行鉴定。结果显示:本试验成功克隆了猪EP1基因,长度为651bp,猪EP1基因在骨髓中的表达量很高;构建了EP1丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-EP1;His6-MBP-EP1融合蛋白在裂解菌液的上清中表达,相对分子质量为65560。结果表明,运用大肠杆菌表达系统成功表达EP1基因融合蛋白,为进一步在体外开展猪EP1基因生物学功能的研究提供基础。     

1株猪流行性腹泻病毒S基因的克隆及序列分析

本研究对分离的1株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因进行克隆和测序,并进行生物信息学分析。通过ORF3序列分析发现,未有核苷酸的缺失,推测为PEDV野毒株。S基因分析结果表明,该毒株(以GD/JMEP表示)与经典的CV777毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性为93.2%,存在多个氨基酸的缺失、插入或者突变;与近几年广东流行的PEDV毒株处于同一个群,亲缘关系较近;相比于经典传统毒株,GD/JMEP株在S基因的几个位点存在核苷酸的缺失或者插入;与目前流行毒株比较,在S基因的406位点存在新的突变。通过氨基酸序列比对分析,GD/JMEP株发生了6个新的氨基酸位点突变,表明本试验检测的GD/JMEP株为目前广东PEDV流行毒株。     

猪巨细胞病毒gB基因的克隆与序列分析

应用PCR方法,从郑州、福建、浙江金华和宁波猪肺脏中分别扩增出4段PCMV gB基因,并将其分别克隆入pMD18-T载体,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,将阳性克隆进行序列分析并构建系统进化树。序列分析表明,其gB基因全长为2 580bp,编码860个氨基酸,与PCMV其他序列相比,其同源性在96.1%～99.7%,与β疱疹病毒亚科中其他常见毒株同源性在25.9%～38.1%;推导的氨基酸序列,有11个半胱氨酸,17个潜在N-糖基化位点,其裂解位点是RYKR;系统进化树分析发现,推导的氨基酸序列出现两个分支,而且来自上述4个地区PCMV gB糖蛋白氨基酸序列处在不同的分支中。     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

GM-CSF在机体免疫系统中发挥重要的免疫调节作用.用PHA与LPS体外联合刺激猪外周血单个核细胞,采用RT-PCR技术成功克隆了猪GM-CSF基因.序列分析表明,该序列与NCBI/GenBank上登载的序列有两个碱基不同;将猪与人、牛、羊、狗、猫、鼠等动物的GM-CSF基因序列相比较,其一致性分别为82.1%、85%、88.1%、82.8%、83.7%、70.5%,在氨基酸水平上一致性为70.3%、70.9%、78.1%、70.3%、71.9%、54.4%.然后利用生物信息学和分子生物学软件,对猪GM-CSF的结构进行预测,结果表明,猪GM-CSF为一结构松散的球状蛋白分子.猪GM-CSF基因的成功克隆及其编码蛋白结构的预测为开发高效、低毒且性质稳定的猪GM-CSF产品奠定了基础.     

猪CD8β基因的克隆、表达及其结构与功能分析

本研究应用RT-PCR技术,从猪胸腺细胞总RNA中扩增、克隆了猪CD8β基因,序列分析表明CD8β含621 bp的开放阅读框,编码207个氨基酸,与NCBI/GeneBank已发表的参考基因的核苷酸及推导氨基酸序列的同源性分别为97.8%和96.8%,与人、小鼠和鸡CD8B蛋白的氨基酸同源性分别为75.7%、67.9%和33.3%.根据大肠杆菌密码子偏嗜性改造目的基因,构建了pET28a/PCD8 β原核表达系统,并经诱导获得高效表达的分子量为24 ku的重组蛋白(rPCD8 β),表达量占菌体蛋白总量的30%.利用生物信息学和分子生物学软件对猪CD8 β基因编码的蛋白进行结构预测,表明猪CD8 β成熟蛋白为跨膜蛋白,其中172aa在胞外区,22aa在跨膜区,10aa在胞内区;蛋白骨架内含有较多的柔性区域,而且分布不均匀.能形成结构松散的球状蛋白;猪CD8 β分子V区三维结构与鼠的具有非常相似的空间结构,与人的差别较大,这为猪CD8B蛋白结构与功能的进一步研究奠定了基础.     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）0RF2基因序列，设计一对引物，应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD—ORF2并对其测序，结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的0RF2基因核苷酸序列同源性在92．1％～99．9％之间，推导的氨基酸序列同源性在90．2％～99．5％之间。     

猪Toll样受体5基因cDNA克隆、蛋白质序列分析及其意义

为了解猪Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和进化关系,本研究从肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪Toll样受体5基因的cDNA序列。序列全长2641bp,其中2571bp的开放阅读框编码856个氨基酸残基的猪TLR5,含17.4%的亮氨酸,并有一段19个氨基酸的信号肽序列;同源性分析结果显示,TLR5在进化过程中具有高度保守性,与人、牛、山羊、绵羊、小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性分别为77.5%、79.6%、78.3%、81.0%、69.2%和68.9%。蛋白分子结构预测结果表明,该分子由胞外区(642个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(191个氨基酸)组成,胞外区具有LRR结构域,胞内区具有TIR结构域,表现出典型的TLR家族结构特征。表明猪TLR5分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用,这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。     

鹅GnRH基因CDS区克隆、序列分析及原核表达

本研究旨在了解鹅GnRH基因的CDS区序列及其蛋白表达情况,研究鹅GnRH蛋白的生理功能,为进一步阐明GnRH蛋白影响鹅繁殖性能的调控机制提供理论基础。采用RT-PCR方法从溆浦鹅下丘脑扩增获得GnRH基因的CDS区序列,将测序正确的DNA序列定向克隆到pET28a(+),构建表达载体pET28a-GnRH,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达目的蛋白,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测和Western blot分析。结果显示:获得的溆浦鹅GnRH基因CDS区部分序列,含有270个核苷酸,编码前体蛋白中的90个氨基酸;溆浦鹅GnRH基因CDS区在大肠杆菌中得到高效表达,GnRH基因CDS区的目的蛋白为9 900,最终测得菌体湿重为0.6g/L,纯化后得到的蛋白为20~30mg/L;清晰检测到GnRH基因表达的蛋白特异带,试验获得的抗体对原核表达的GnRH蛋白具有特异性反应;鹅GnRH基因在动物进化中高度保守,研究得到的鹅GnRH前体蛋白可为进一步研究GnRH基因的生物功能以及其对鹅就巢、产蛋等繁殖性状的影响奠定基础。     

扬州鹅NPFFR1基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达检测

本研究旨在对鹅促性腺激素抑制激素受体基因(NPFFR1)进行克隆及生物信息学分析,并检测其在鹅不同组织中的表达。利用鸡NPFFR1基因为种子序列,采用RT-PCR方法克隆出扬州鹅NPRRF1基因,并通过相关软件对基因序列进行生物信息学分析。结果显示:共发现扬州白鹅NPFFR1基因的两种剪接形式:剪接体1的ORF大小为1 200 bp,编码399个氨基酸;剪接体2的ORF大小为432 bp,编码143个氨基酸,相对剪接体1缺失31 bp。对其进行生物信息学分析发现,鹅NPFFR1基因与鸡NPFFR1基因CDS序列同源性为92.8%,其产物是一种不稳定、疏水性蛋白,主要分布在细胞膜上;蛋白质跨膜结构预测显示鹅NPFFR1蛋白含有7个跨膜结构,属于跨膜蛋白,无信号肽片段。对产蛋末期母鹅10个组织样品的cDNA实时定量PCR结果显示,NPFFR1基因在各组织中均有表达,在下丘脑中表达最高,其次是腹脂、小肠、卵巢、胃、垂体、心脏、肌肉,在肾脏以及肝脏中表达很低。研究结果为今后探究鹅NPFFR1蛋白的相关功能及与其他蛋白质的相互作用提供了理论依据,同时为扬州鹅生殖轴调控产蛋性能的机理研究提供参考。