鲤I-IFN-γ作为锦鲤疱疹病毒核酸疫苗免疫佐剂的效果研究

为了研究鲤Ⅰ-IFN-γ的免疫效果,根据鲤Ⅰ-IFN-γ的mRNA基因序列(GenBank),构建真核表达质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ,重组表达质粒与不同剂量的转染试剂EndoFection TM Max混合后转染鲤鱼肌肉细胞,通过荧光倒置显微镜观察,重组表达质粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ在细胞中成功表达。以多种免疫剂量的重组表达质粒与pIRES-ORF81混合对鲤鱼进行肌肉注射,每周免疫一次,共免疫三次,免疫前采血,收集血清,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体水平。结果表明:于第三次免疫后两周,抗体水平达到最高,联合免疫与单独免疫核酸疫苗pIRES-ORF81相比,抗体水平明显升高,但差异不显著(P0.05)。鲤Ⅰ-IFN-γ作为锦鲤疱疹病毒的免疫佐剂具有一定的免疫效果。     

一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定

本实验对患病鲤鱼进行病毒分离及鉴定,将表现典型锦锂疱疹病毒(KHV)病症状的鲤鱼肾细胞与单层框镜鲤鱼鳍细胞(KFC)共培养,5d～6d后出现典型的KHV细胞病变,即细胞体积增大并出现空泡化;在电镜下观察到典型的KHV病毒粒子;并应用PCR方法扩增获得KHV ORF25基因的849bp基因片段,连接至pMD18-T载体中,经酶切鉴定后序列分析表明,与GenBank登录的3株KHV同源性均为99.9%,命名为KHV-cj.基因进化比较显示,与KHV-J株关系较近.将病毒培养物(10-6.75TCID50)腹腔注射接种实验鱼可使其100%发病,并且症状和病理变化与自然感染KHV的鱼一致,死亡率为75%.表明本研究在国内首次分离到KHV.     

影响核酸疫苗免疫效果的因素及提高核酸疫苗免疫效果的方法

核酸疫苗(nucleic acid vaccines)是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内,并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的.     

锦鲤疱疹病毒的PCR鉴定

根据锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)的基因序列合成了2对引物,对送检的发病锦鲤样品提取DNA进行PCR检测,分别扩增出KHV的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(thymidine kinase,TK)409 bp和AF411803基因序列484 bp的条带,对484 bp的PCR扩增产物经限制性内切酶TaqⅠ和AluⅠ酶切,分别得到200 bp/284 bp和185 bp/299 bp的片段,484 bp的PCR扩增产物的测序结果与GenBank上已发表的KHV序列一致。结果显示发病锦鲤为KHV阳性。     

核酸疫苗的免疫效果与安全性

核酸疫苗是通过基因重组手段将编码某种抗原蛋白质的基因与载体重组后直接导入动物体内,在宿主体内表达抗原从而引起机体免疫应答的新型疫苗,是一种与传统疫苗截然不同的新型疫苗,被誉为第三代疫苗。核酸疫苗可诱导细胞免疫并可抵抗母源抗体干扰,它的诞生给基因治疗和免疫学领域带来了不可估量的前景。核酸疫苗目的基因、质粒载体的选择,接种剂量以及应用的佐剂等因素直接影响到核酸疫苗的免疫效果。DNA疫苗自诞生以来,其安全性一直是人们关心的问题,也是DNA疫苗得以日后应用于临床的关键。     

提高核酸疫苗免疫效果的策略

核酸疫苗因能诱导机体产生保护性免疫,且具有安全、热稳定性、价廉等优点而受到高度重视,如何提高核酸疫苗的免疫效果一直是核酸疫苗研究的热点和难点问题。文章主要从优化方法着手,就核酸疫苗研制中质粒载体的构建、抗原加工分子的联合应用、接种途径和剂量以及核酸疫苗在禽病上的应用做一综述。     

锦鲤疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据锦鲤疱疹病毒(KHV)胸苷激酶(TK)基因的保守序列设计一对引物和相应的TaqMan探针,建立荧光定量PCR方法,用于锦鲤疱疹病毒快速、灵敏、可定量的检测手段。构建并制备实时荧光定量PCR的标准品,对反应体系进行优化,并做特异性,敏感性和重复性试验。结果表明,成功构建荧光定量PCR标准品,建立荧光定量标准曲线,标准曲线的相关系数为0.992,所建立的荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高,重复性好。     

锦鲤疱疹病毒双基因检测方法的研究

为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)双基因检测方法,本研究根据KHV聚合酶基因(Sph)和胸苷激酶基因(TK)的保守序列设计2对引物,建立两基因同时检测的PCR方法.结果表明,利用双基因同时检测KHV,可以同时特异扩增出570 bp和155 bp片段,而与鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤鱼疱疹病毒无扩增反应.而且所建立的双基因检测方法对临床样品的检测结果与单一PCR方法比较符合率为100％.为进一步研究KHV以及诊断方法奠定了基础.     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF126基因的原核表达及免疫试验研究

为了研究能有效预防锦鲤疱疹病毒的疫苗,选取了锦鲤疱疹病毒膜糖蛋白基因ORF126并构建重组质粒p ET32aORF126,SDS-PAGE检测获得含his标签大小为49.9 k Da的蛋白条带。蛋白纯化后免疫鲤鱼,采集不同天数血清,用间接ELISA检测抗体水平。结果显示,用10μg/尾、20μg/尾和40μg/尾的蛋白免疫后均可检测到KHV的抗体,3者之间的抗体水平差异不显著(P>0.05)。     

锦鲤疱疹病毒双重PCR检测方法的研究

为了快速确诊锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV),本试验建立了KHV双重PCR检测方法。根据锦鲤疱疹病毒的SphⅠ-5基因和胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(thymidine kinase,TK)基因设计特异性引物,优化反应条件,建立了KHV双重PCR检测方法。结果表明,建立的方法简单、灵敏、准确,一个反应体系可同时扩增292 bp和410 bp两个基因片段,可有效用于KHV的检测。     

不同免疫途径对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响

为探讨不同免疫接种途径对鸡新城疫(ND)弱毒疫苗免疫效果的影响,我们将健康1日龄海兰蛋公鸡雏鸡(48只)随机分为滴鼻免疫组、肌肉注射免疫组、后海穴常规剂量免疫组和后海穴半剂量免疫组,每组12只.分别于第14日龄和28日龄接种新城疫IV系弱毒苗(LaSota株)1羽份/只,后海穴半剂量免疫组接种0.5羽份/只.分别于免疫前和免疫后7、14、21d和28d称重,无菌操作采血,分离血清,检测血清中的血凝抑制效价(HI).结果显示:与常规途径免疫组相比,后海穴常规剂量免疫组和后海穴半剂量免疫组可显著增强鸡血清NDV特异性HI效价(P＜0.05),且显著提高试验鸡只的日增重(P＜0.05);滴鼻免疫组与肌肉注射免疫组相比,虽然增加了HI效价,但统计学比较差异不显著(P＞0.05).试验结果说明后海穴接种鸡新城疫疫苗可显著提高鸡血清NDV的HI效价,提高鸡生产性能,同时节约疫苗用量.     

核酸免疫与核酸疫苗

核酸疫苗是最近几年从基因治疗研究领域发展起来的一种全新免疫防治剂。核酸疫苗是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体作为疫苗 ,直接导入动物细胞内 ,通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白 ,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答 ,从而使被接种动物获得相应的免疫保护。免疫应答包括细胞激活、细胞因子分泌、细胞毒淋巴细胞 (CTL)产生以及特异性抗体形成等。因此 ,核酸疫苗又称基因疫苗或裸DNA疫苗。这种免疫称为核酸免疫、基因免疫、遗传免疫或DNA介导免疫等。核酸疫苗与传统疫苗相比有许多潜在的优势 ,从而被誉为第三次疫苗革…     

兽用核酸疫苗的研究进展

核酸疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗,它应用现代生物工程和分子生物学技术,克服传统疫苗存在的问题,具有传统疫苗不可比拟的优点,呈现出良好的发展势头和应用前景。在兽用领域中,新城疫、禽流感、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎等疾病的核酸疫苗得到了较为深入的研究,为兽用核酸疫苗乃至其他领域核酸疫苗的进一步研究提供了有益的参考。     

猪轮状病毒核酸免疫的研究

将昆明鼠随机分为A、B两组,分别肌肉注射含有猪轮状病毒(RV)JL94株VP7基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP7和真核表达载体pcDNA3.1( ),每只鼠100μg/100μL,共免疫3次,每次间隔2周.首次免疫第0、14、21、21、28、39、47、54d采血,检测血清抗体和外周血淋巴细胞中CD4 、CD8 T细胞的数量变化.A组小鼠血清在首免后第14 d即可检出阳性抗体(P/N≥2.0).A组与B组小鼠外周血CD4 、CD8 T细胞数量在首免后第14d开始有显著差异(P＜0.05).     

天津市锦鲤疱疹病毒PCR检测与序列分析

2017年6月,天津市滨海新区、北辰区等地一些养殖场的锦鲤出现急性死亡,发病3 d后死亡率高达85%以上。病鱼呈现眼部凹陷、烂鳃、内脏出血等临床症状,初步诊断为锦鲤疱疹病毒病。针对锦鲤疱疹病毒(KHV/CyHV)的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因设计特异性引物,建立PCR方法进行KHV基因检测。结果显示:死亡疑似病例的KHV检测阳性;测序获得的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因片段长度分别为409、300、317、939和156bp,与CyHV-3-J2病毒株基因序列同源性为97.6%～100%。系统发育树分析显示,其与CyHV-3亲缘关系最近,自然聚为一支,最终确定为CyHV-3型。以上研究为锦鲤疱疹病毒病的分子诊断及流行病学调查奠定了基础。     

Immune Efficacy of different immunization doses of divalent combination DNA vaccine pOPRL+pOPRF of Pseudomonas aeruginosa

At present, there is no vaccine available against Pseudomonas aeruginosa, a common zoonotic pathogenic bacterium. In a previous study, the authors prepared a divalent combination DNA vaccine, pOPRL+pOPRF, which exhibited good protective efficacy. To explore the optimal immunization dose of this divalent combination DNA vaccine, in the present study, chickens were vaccinated with 25, 50, 100, and 200 µg doses. The levels of serum antibody, interferon-γ (IFN-γ), and interleukin-2 (IL-2) were determined, and lymphocyte proliferation assays were performed. After challenge with virulent P. aeruginosa, the protective efficacy was evaluated. Following vaccination, the serum antibodies, stimulation index values, and concentrations of IFN-γ and IL-2 were significantly higher in chickens vaccinated with 100 and 200 µg vaccines than in those vaccinated with 25 and 50 µg doses (P<0.05). IFN-γ and IL-2 concentrations in chickens immunized with 100 µg vaccine were slightly higher than those in chickens immunized with 200 µg vaccine, although the difference was not statistically significant. The protective rates were 55%, 65%, 85%, and 85% with 25, 50, 100, and 200 µg of the pOPRL+pOPRF DNA vaccine, respectively. Thus, the immune efficacy of the pOPRL+pOPRF DNA vaccine increased with an increase in immunization dose, but this does not imply that a higher dose necessarily achieves a better outcome. The optimal immunization dose of pOPRL+pOPRF DNA vaccine in chickens was 100 µg.     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF136基因的原核表达及免疫原性研究

为了研究能有效预防锦鲤疱疹病毒的疫苗,本文研究克隆了锦鲤疱疹病毒ORF136基因,并构建重组质粒PET32a-ORF136,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测获得含his标签大小为36.4kDa的蛋白条带。蛋白纯化后免疫鲤鱼,不同天数采血收集血清用间接ELASA检测抗体水平。结果显示：用10ug/尾、20ug/尾和40ug/尾的蛋白免疫后均可检测到KHV的抗体,用PET32a-ORF136表达的蛋白20ug/尾和40ug/尾的蛋白免疫后的抗体水平比10ug/尾剂量蛋白免疫后的抗体水平高但差异不显著（p＞0.05）。     

不同免疫程序对猪蓝耳病疫苗免疫效果的影响

为研究不同免疫程序对猪蓝耳病疫苗免疫效果的影响,本试验选取42头未免健康断奶仔猪,随机分为4组。A组对照组,B组免疫弱毒苗组,C组免疫灭活苗组,D组同时免疫弱毒苗和灭活苗组。分别在免疫前和免疫后第14,28,42,56,70天前腔静脉采血,采用ELISA方法检测特异性抗体,同时检测淋巴细胞转化率以及IFN-α、IFN-γ、TNF-α等细胞因子水平。结果显示:免疫后,B组抗体水平显著高于D组(P<0.05)、A组(P<0.01);在免疫后第42天,D组淋巴细胞转化率显著高于B组、C组(P<0.01),显著高于A组(P<0.01),免疫后第56天,B组淋巴细胞转化率高于C、D组(P<0.05);B组细胞因子水平在免疫后第14天高于其他3组,加强免疫后细胞因子水平均有所下降,在免疫后第70天时升高。结果表明,免疫蓝耳病弱毒苗组免疫效果优于免疫灭活苗组和两种疫苗同时免疫组。     

外源性核酸对感染IBDV雏鸡免疫功能和抗氧化能力的影响

300只20日龄健康海兰白雏鸡随机分为6组,Ⅰ组为对照组,Ⅱ～Ⅵ为试验组,Ⅱ、Ⅴ组饲料中分别添加0.1%核酸,Ⅲ和Ⅵ组分别添加0.2%核酸,Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组于27日龄感染传染性法氏囊病毒(IBDV),分别于30,33,36,39,42日龄心脏采血测定T淋巴细胞转化率,白细胞的吞噬率,SOD、GSH-Px和CAT活性,用流式细胞仪测定鸡脾脏T淋巴细胞亚群的变化;时处死雏鸡,测定免疫器官法氏囊和脾脏指数,观察其组织结构.结果表明,日粮中添加不同剂量的核酸均可提高T淋巴细胞转化率和T淋巴细胞数,法氏囊和脾脏的相对质量均明显增加,并能促进法氏囊和脾脏的快速发育,提高脾淋巴细胞中CD3+、CD4+和CD8+T细胞百分率,改变CD4+/CD8+比值促进对机体免疫系统的调控,增强白细胞的吞噬功能;可显著提高鸡血清中SOD、GSH-Px和CAT活性.IBDV感染组与病毒感染加核酸组之间上述指标差异显著,感染IBDV组可使上述指标明显下降,感染IBDV加核酸组的上述指标接近正常对照组,说明核酸能补偿IBDV对雏鸡免疫系统的抑制作用,具有一定的抗氧化能力,而且能促进雏鸡修复组织损伤.     

禽流感病毒HA基因核酸疫苗脂质体制备方法的研究

用逆相法、冷冻溶融法、冻干法、脂膜法制得了禽流感病毒血凝素(HA)基因重组质粒pSVH7DNA(核酸疫苗)脂质体;用荧光法测得脂质体的包封率分别为(15.58士1.55)％,(14.7土0.79)％,(11.43士1.76)％,(6.08士0.35)％,当在磷脂成分中加入阳离子脂时,脂质体的包封率分别为(70.41士6.49)％,(57.58士0.88)％,(53.72士9.07)％和(46.56士1.92)％。电镜观察发现四种方法所得的脂质体为单室和多室球形脂体混合物,其粒径大小分别为163nm,189nm,138nm和235nm,结果表明逆相法、冻干法、冷冻溶融法为制备脂质体的有效方法。