猪H3N2亚型流感病毒受体亲和性鉴定

利用固相酶联方法对分离自吉林省猪群中的3株H3N2亚型流感病毒进行了受体亲和性鉴定.结果显示,这3株病毒与SAα2,3和SAα2,6受体都能结合,并且偏嗜SAα2,6受体,暗示它们具有感染人的潜能.因此应该加强猪流感的流行病学调查,及时发现那些具有引发人流感流行潜能的病毒,为防控人间流感提前做好准备.     

禽H9N2亚型重组流感病毒疫苗候选株的构建及其免疫效果评价

以G57基因型分离株A/Chicken/Jilin/DH104/2012(H9N2)为HA和NA基因的供体,以A/Swan/Jilin/SN8/2009(H11N6)的6个内部基因作为疫苗候选株的骨架,利用反向遗传技术拯救了1株重组H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rDH104。将该重组病毒灭活后免疫7日龄SPF鸡,28日龄加强免疫1次,血清HI抗体保护水平至少可以维持58d,表明该重组病毒具有良好的免疫原性。本试验为研制与当前H9N2亚型禽流感病毒流行株抗原性相匹配的候选疫苗株提供了依据。     

G1-like型禽H9N2亚型重组流感病毒的拯救及免疫原性评价

为拯救具有高复制特性的G1-like型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)疫苗候选株,利用反向遗传操作技术,将高复制特性H9N2亚型CZ株(Y280-Like)的6个内部基因(PB2、PB1、PA、M、NP、NS)与H9N2亚型40926株(G1-like)的HA和NA基因进行重配,构建G1-like型重组病毒。通过HA、HI试验及基因测序对拯救病毒进行鉴定,并对病毒在鸡胚上的复制能力、遗传稳定性及免疫原性进行评价。结果表明,利用6+2质粒系统成功拯救出G1-Like型H9N2亚型重组流感病毒,并具有良好的复制特性和遗传稳定性;将拯救的重组病毒株灭活后免疫SPF鸡,能刺激产生较高的HI抗体,为防控G1-like型AIV流行提供了技术和疫苗候选株储备。     

鸡源株与人源株H9N2流感病毒血凝素受体结合位点氨基酸比较与分析

H19N2病毒可以感染多种禽类和哺乳动物，包括人类。流感病毒血凝素受体结合位点的氨基酸可以影响受体结合特性。为了解鸡源株与人源株H19N2病毒受体结合部氨基酸的差异，作者对二者进行了比较与分析，结果表明，鸡源株与人源株血凝素受体结合部位氨基酸的第137、183、190、226位点存在差异，鸡源株在这些位点分别为K、N、AorVorT、LorQ而人源株则分别为R、H、E、L。虽然尚不清楚这些位点的改变对病毒与细胞亲和力及宿主范围的影响，但由于H9N2在我国养鸡业的普遍存在，加强H9N2病毒的分子流行病学监测有重要意义。     

H9N2亚型禽流感疫苗株的筛选

为了筛选免疫原性更好的H9N2亚型禽流感病毒疫苗株。本研究在分析H9N2病毒HA基因遗传进化规律基础上,对预选的毒株进行血凝效价(HA)、鸡胚半数感染量(EID50)测定及交叉血凝抑制试验,筛选出疫苗用毒株进行免疫攻毒保护试验。结果显示,CK/AH/AJ3/15株HA效价达11 log2、EID50值为9.17 log10/0.1 mL,有很好的繁殖能力;对当前流行株的HI反应效价比疫苗株F/98高2-3个滴度;以CK/AH/AJ3/15株制作灭活疫苗,整体保护率达到97.5%,比F/98疫苗株的85%明显提高。表明CK/AH/AJ3/15株可以作为H9N2亚型禽流感新型疫苗株的候选株。     

猪源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

2008年10月~2009年3月采集剖检病死猪喉拭样品41份,从中分离鉴定了2株H9N2亚型猪流感病毒,对其进行部分生物学特性的研究、全基因测序和遗传演化分析,发现血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白335~338的裂解位点上,A/Swine/Yangzhou/1/08为RSNR,A/Swine/Taizhou/5/08为RSSR,均为典型低致病性禽流感病毒的特征性序列。2株病毒的HA、神经氨酸酶（neuraminidase,NA）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,NP）、非结构蛋白（nonstructural protein,NS）、血清前白蛋白（prealbumin,PA）和多聚酶蛋白（polymerase protein1,PB1）基因均来源于A/Chicken/Shanghai/F/98,基质蛋白（matrix,M）基因与A/Swine/Yangzhou/1/08的PB2基因来源于A/Quai/Hong Kong/G1/97,值得注意的是A/Swine/Taizhou/5/08的PB2基因虽然可能来源于A/Chicken/Shanghai/F/98但与A/environment/Hunan/1-35/2007（H5N1）的高度同源,生物学特性试验也表明A/Swine/Taizhou/5/08比A/Swine/Yangzhou/1/08毒力强。     

一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从福州市某活禽市场采集的鸡泄殖腔棉拭子样品中分离出1株病毒,经血凝抑制试验(HI)和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank基因库中对该病毒株的3个基因片段的测序结果进行BLAST比对分析表明,3个基因片段均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因。HA基因遗传进化分析表明,该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97处于同一分支,与上海的鸡源分离株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)同源性最高,同源性为99.5%。     

H9N2亚型流感病毒对商品代肉雏鸡免疫系统的影响

对H9N2亚型流感病毒感染商品代肉雏鸡免疫器官的病理组织学变化进行了系统研究。结果显示,感染H9N2后胸腺、法氏囊、脾等均表现不同程度的病理学损伤;人工感染H9N2亚型流感病毒后,用新城疫(ND)疫苗免疫,其ND的HI抗体滴度较对照组有所下降,说明H9N2可对雏鸡造成严重的免疫抑制。     

血凝素的糖基化模式对G57基因型H9N2亚型禽流感病毒的稳定性和受体亲和性影响

G57基因型H9N2亚型禽流感病毒自2007年以来逐渐成为我国禽群中的优势基因型。序列分析显示,G57基因型病毒的血凝素主要存在5种糖基化模式。本研究利用反向遗传技术拯救了5株具有不同HA糖基化模式的病毒,分别命名为reHA7、reHA6、reHA5、reHA4、reHA3。稳定性试验结果显示,reHA6的热稳定性与酸稳定性最好,reHA7、reHA5次之,而reHA4、reHA3最弱。红细胞洗脱试验和红细胞凝集试验结果显示,reHA7的受体亲和性最强,reHA6、reHA5次之,而reHA4、reHA3最弱。固相结合试验结果显示,5株病毒均可与人型和禽型受体结合,并且reHA7与2种类型受体的亲和性最强,reHA6、reHA5次之,而reHA4、reHA3最弱。结果表明,血凝素糖基化模式影响H9N2亚型禽流感病毒的稳定性和受体亲和性,并以210位和305位糖基化位点的效应最为显著。本研究结果为深入理解H9N2亚型禽流感病毒的适应性进化提供了新的理论基础。     

山东猪流感病毒H9N2亚型毒株的分离鉴定

近年来春秋和冬季在山东各地猪场不断出现疑似猪流感的呼吸道疾病 ,2002年10月到2003年2月 ,我们从山东发病猪场采集发病猪的鼻咽棉拭子和死亡猪的肺脏 ,接种SPF鸡胚 ,获得血凝性稳定且血凝价较高的尿囊液样品58份 ,对其中10个样品的亚型进行鉴定 ,并将具有代表性的一株病毒的血凝素全基因及其它基因进行了测序与分析。1检测与鉴定方法1.1SPF鸡胚、小白鼠分别由山东齐鲁制药厂和泰安生物制品厂提供。1.2疑似猪流感病猪样品的采集2002年10月 -2003年2月 ,从山东的济宁、宁阳、莘县、邹城、莱芜、梁山、莒南等地对疑似猪流感病例进行诊断 ,…     

利用反向遗传技术拯救H9N2重组病毒

为研制高效特异的H9N2亚型AI疫苗,选取我国具有代表性的毒株A/chicken/Shanghai/10/01(H9N2)(简称SH10),以12质粒系统为基础,利用反向遗传操作技术构建了1株表面基因由SH10提供、内部基因由12质粒系统提供的重组病毒SH/PR8,为新型疫苗的研制提供了新的毒株。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-THA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因，将扩增到的HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移栽体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞，经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒，用其感染Sf9昆虫细胞，并优化表达条件。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明，表达产物的分子质量约为27ku。Dot-ELISA分析表明，表达的HA2融合蛋白可与鸡抗HgN2亚型血清发生特异性反应，而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。     

表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白重组乳酸杆菌的构建

H9N2亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因经树突状细胞靶向肽(DCpep)与异亮氨酸拉链(GCN4)基因修饰后,插入到穿梭表达载体p SIP409中,将质粒电转化至乳酸杆菌内。结果表明,该重组乳酸杆菌经诱导后,能够表达大小约为63 000且具有反应原性的蛋白,为进一步探讨重组乳酸杆菌在激发黏膜免疫反应过程中,DC调控黏膜免疫应答的机制及研制抗禽流感口服疫苗奠定基础。     

一株H9N2亚型猪流感病毒的遗传进化和致病性分析

本研究从有流感症状的病猪中分离到一株H9N2亚型猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Jiangsu/1/2015(SW/JS/1/15)。为探究其遗传特征和生物学特性,本研究采用RT-PCR技术扩增其全部基因节段后测序并进行遗传分析,并研究了其对鸡和豚鼠的致病特性。遗传进化分析显示,分离病毒SW/JS/1/15株是由BJ/94系、DK1系、G1系和F/98系4个分支病毒重组而成,8个基因节段均属于G57基因型。分离株HA蛋白裂解位点为PSRSSR*GL,符合低致病性流感病毒的特征。HA蛋白有9个潜在糖基化位点,其中218位糖基化位点缺失,145位与313位各新增一个糖基化位点。与疫苗株SH/F/98、SD/6/96、GD/SS/94相比,分离病毒HA抗原位点发生了G^90E、S^127R、S^145N、D^153G、N^167S、A^168N、A^198T、T^200R、N^201D、和Q^235M(H9numbering)突变;NA蛋白发生6个氨基酸突变:K^367R、K/E^368N、D^369N、D^401E、K^143N和T^434P。同时NA蛋白颈部缺失aa63~aa65。分离病毒的8个基因节段与2株禽源H9N2病毒的相应基因高度同源,其6个内部基因与两株人源H7N9病毒的内部基因高度同源。致病性试验结果显示分离病毒可以感染鸡和豚鼠,但不能在豚鼠群内水平传播,且可能作为H7N9等新型流感病毒内部基因供体,同时表明猪可以感染禽流感病毒(AIV),且可能是AIV获得感染哺乳动物能力的过渡宿主。本研究为H9N2亚型SIV的致病性以及遗传特征的研究提供科学依据。     

猪源H9N2亚型流感病毒HA基因的序列测定及真核表达

利用RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Zhejiang/7/2004(H9N2)(SW/ZhJ7/04)HA基因,测序后将其克隆到真核表达载体pCAGGS上,经酶切分析、PCR鉴定和测序验证,得到重组表达质粒pCAGGS-HA,之后将其转染293T细胞,48h后收集转染细胞样品,进行SDS-PAGE分析,结果显示HA蛋白获得了表达。经Western blot检测,结果表明pCAGGS-HA能够在体外瞬时表达具有免疫学活性的HA蛋白,通过免疫小鼠,对其免疫效果进行了初步研究。     

H9N2亚型猪流感病毒对小鼠的致病性及其分子特性研究

本实验从河北地区疑似流感发病猪体内分离到一株病毒,经鉴定为H9N2亚型猪流感(SIV)病毒.将该分离株经滴鼻、点眼途径感染小鼠,观察临床症状和病理变化,同时对血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)和基质蛋白基因(M)进行克隆和序列测定,与GenBank中登录的相关序列进行比对并绘制系统发育进化树.致病性结果显示:感染小鼠出现精神不振,体重下降,并引起以弥漫性肺泡损伤为主的临床症状和病理变化.序列分析结果显示:该分离株与禽流感病毒(AW) A/chicken/Hebei/4/2008 (H9N2)(简称CK/HB/4/08)参考株的HA、NA、NP和M基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性最高.HA蛋白的裂解位点序列为PARSSR↓GLF,属于低致病性流感病毒的裂解位点.HA、NP、NA和M基因的遗传进化分析均显示该分离株与AIV的CK/HB/4/08株位于同一分支,具有较近的亲缘关系;由此推测该分离株可能是由CK/HB/4/08演化而来,并在跨物种传播的过程中发生了部分变异.     

2011～2014年广西H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传变异分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒广西分离株的遗传变异情况,采用RT-PCR技术扩增了10株从2011~2014年广西不同地区分离的H9N2亚型AIV的HA基因片段,并对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,10个毒株的HA基因全长1 683 bp,编码560个氨基酸;10株分离株的裂解位点均为PSRSSR↓GLF,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列。10株分离株234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α-2,6受体结合的特征。分离株与参考毒株HA基因的核苷酸与氨基酸同源性均较高,分别为79.3%~98.7%和85.0%~98.6%,均属欧亚种系,其中与A/Duck/Hong Kong/Y280/97亲源关系较近。研究结果从分子水平上证明H9N2亚型禽流感病毒近年来未发生较大变异。     

免疫鸡群中分离的H9N2亚型禽流感病毒的分子特征研究

为研究浙江省禽流感病毒(AIV)的流行病学情况,本实验应用鸡胚传代方法从AIV疫苗免疫鸡群中表现典型呼吸症状的产蛋鸡体内分离1株H9N2亚型AIV A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)。氨基酸序列分析显示,HA受体结合位点出现了人流感病毒结合位点226L,M基因出现S31N的突变。遗传进化分析显示,A/Chicken/Jiande/01/2009的M基因和PB2基因属于G1-Like谱系,HA基因、NA基因和NS基因属于Ck/BJ/1/94-Like分支,而NP基因、PA基因和PB1基因属于Ck/SH/F/98-Like谱系。这些资料表明,A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)为一株重排病毒。     

猪流感病毒H9N2亚型济南株HA、NA基因的克隆与序列分析

根据GenBank中流感病毒H9N2亚型HA基因与NA基因序列,分别设计扩增HA基因与NA基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒H9N2济南株(SW/SD/JT/07)HA基因和NA基因,分别将RT-PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果表明,SW/SD/JT/07 HA基因长度为1701bp,编码566个氨基酸,HA0切割位点序列为R-S-S-R-G,属非高致病性毒株;HA蛋白有8个糖基化位点,与参考毒株糖基化位点数一致;HA蛋白有5个受体结合位点,其中在190位氨基酸与其余参考毒株存在差异。SW/SD/JT/07 NA基因长度为1413bp,编码470个氨基酸,NA蛋白基质结合部与参考毒株一致,高度保守;NA蛋白有5个抗原位点,在325位为D其余参考毒株均为N,SW/SD/JT/07与DC/HB/W1/04,CK/GS/2/99在398位为E,其余参考毒株为D或N;SW/SD/JT/07 NA蛋白与CK/SH/F/98,DC/HB/W1/04,CK/GS/2/99,SW/GD/WXL/04,SW/SD/W4/03,SW/YN/Simao2/07一样在茎区63,64,65位发生氨基酸缺失。SW/SD/JT/07 HA基因与参考毒株的同源性82.5%～98.6%,NA基因与参考毒株的同源性82.2%～99.1%。SW/SD/JT/07 HA基因与NA基因系统发生树分析表明,SW/SD/JT/07与AIV H9N2亚型亲缘关系密切。     

H9N2亚型鸡源禽流感病毒分离与鉴定

禽流感 (AI)又名真性鸡瘟或欧洲鸡瘟 ,是由正粘病毒科 A型流感病毒引起的一种传染病 ,是国际兽医局规定的 A类烈性传染病。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及其他野禽均可感染。我们从新乡市某蛋鸡场分离鉴定 1株低致病力的 H9N2亚型的禽流感病毒毒株 ,现报告如下。1　材料与方法1.1　材料　病料来自河南职业技术师范学院禽病研究所接诊检验的病、死鸡。禽流感 A型琼扩抗原、标准阳性血清以及抗 HA、NA分型血清购自中国农科院哈尔滨兽医研究所 ;抗新城疫 (ND)血清和抗减蛋综合征 (EDS- 76 )血清由本院禽病研究所提供。 SPF鸡胚和雏鸡购自…