梅花鹿鹿茸表皮生长因子基因原核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体pMD-18T-EGF,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切克隆质粒pMD-18T-EGF后,回收EGF基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pET32a原核表达载体中,获得重组质粒pET32a-EGF。经限制性内切酶分析和PCR鉴定,结果表明:成功地构建了原核重组质粒。     

IGF-1对梅花鹿鹿茸软骨细胞ColⅠ表达的影响

以梅花鹿茸角为研究对象,探讨胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对鹿茸软骨细胞Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)表达的影响。分离培养鹿茸软骨细胞,分别添加IGF-1重组蛋白、IGF-1受体抑制剂(PQ401)和IGF-1重组蛋白,同时构建IGF-1过表达载体并合成siRNA,转染鹿茸软骨细胞,通过荧光定量PCR方法检测软骨细胞去分化标志分子ColⅠ表达的变化。荧光定量PCR结果显示,添加IGF-1重组蛋白后,随着时间的增加,ColⅠmRNA在鹿茸软骨细胞中的表达量逐渐下降,添加PQ401后,IGF-1抑制ColⅠmRNA表达的作用减弱;转染IGF-1过表达载体后,ColⅠmRNA在鹿茸软骨细胞中的表达量显著降低,而转染IGF-1siRNA后其表达量则显著升高。结果表明,IGF-1可能在鹿茸软骨细胞去分化过程中起重要的作用。     

CYP7B1和CYP4B1基因mRNA在不同毛色贵州剑白香猪皮肤组织中的表达分析

为了分析CYP7B1、CYP4B1基因在剑白香猪的黑色和白色皮肤组织中的表达差异,试验通过提取剑白香猪黑色和白色皮肤组织的RNA,分别逆转录合成相应的cDNA;以GAPDH基因作为内参,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测CYP7B1、CYP4B1基因mRNA在黑色和白色皮肤组织中的相对表达量。结果:CYP7B1、CYP4B1基因在剑白香猪黑色皮肤中表达量较高,在白色皮肤组织中表达量很少甚至几乎不表达。结论:推测CYP7B1、CYP4B1基因可能与剑白香猪黑色皮肤的形成有关,为进一步研究CYP7B1、CYP4B1基因在香猪的黑色和白色皮肤组织中的功能提供数据基础。     

水牛HSD17B1基因克隆分析及其真核表达载体构建

为了阐明水牛17β-羟类固醇脱氢酶1 (17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1,HSD17B1)基因对水牛繁殖性能的影响,本试验采用了3'-RACE克隆获得HSD17B1基因,并对其核苷酸序列和蛋白质序列进行了生物信息学分析,通过构建其真核表达载体并转染293T细胞验证所构建载体的准确性。结果表明,水牛HSD17B1基因编码区长954 bp,3'-UTR区长58 bp,编码317个氨基酸。BLAST分析显示水牛HSD17B1核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、犬、非洲象和人的相似性分别为100%、100%、92%、94%、87%、87%和87%,系统进化树分析结果表明,HSD17B1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性。蛋白质分析结果表明HSD17B1蛋白呈弱酸性,无信号肽,亚定位于细胞质,存在type1_17beta-HSD-like_SDR_c、PRK05993、LPOR和FabG等结构域。试验成功构建了水牛HSD17B1基因真核表达载体pEGFPN1-HSD17B1,转染293T后,产生较强的绿色荧光信号,表明能够形成HSD17B1-EGFP融合蛋白。水牛HSD17B1基因的克隆及其真核表达载体的成功构建,为今后阐明HSD17B1基因在水牛卵泡及胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了理论基础。     

猪Mx1基因真核表达载体的构建及表达

根据GenBank中猪Mx1基因序列设计并合成引物,对Mx1基因ORF区全长1 992个碱基进行扩增。将扩增片段与pVax1载体连接,构建pVa-Mx1-ORF真核表达载体。将构建的表达载体导入BHK-21和HEK-293细胞进行表达,用RT-PCR和间接免疫荧光对表达产物进行鉴定。结果表明,所构建的pVa-Mx1-ORF表达载体在BHK-21和HEK-293细胞中成功表达。     

梅花鹿IGF-1干扰载体的构建及其对鹿茸间充质细胞生长调控作用

IGF-1对鹿茸生长有重要调控作用,为进一步研究该基因对鹿茸间充质细胞生长的调控作用,本研究利用RNAi-Ready p SIREN-Retro QZs Green plasmid构建了IGF-1干扰重组载体,转染鹿茸间充质细胞,应用Western-blot、流式细胞术、MTT等方法,研究了IGF-1对细胞增殖、凋亡和细胞周期的调控作用,结果表明:干扰IGF-1表达会抑制鹿茸间充质细胞增殖,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期。     

奶牛生物钟基因BMAL1真核表达载体的构建及生物信息学分析

本研究旨在克隆奶牛脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1基因（Brain and Muscle Arnt-Like Protein 1,BMAL1）的蛋白编码序列（Coding Sequence,CDS）并构建其真核表达载体,运用生物信息学方法解析其CDS序列和编码蛋白特性。以牛肝脏组织为材料,利用PCR技术扩增奶牛BMAL1基因中带有同源臂的CDS片段。采用同源重组法,将目的片段连接至酶切线性化的pc DNA3.1-Puro-N-3HA真核表达载体上,酶切及测序结果均符合预期的质粒命名为pc DNA3.1-3HA-c BMAL1。将空载与重组质粒分别转染至HEK293T细胞,通过实时荧光定量PCR技术（q PCR）和Western Blotting技术检验奶牛BMAL1基因的过表达效果,并利用生物信息学软件分析BMAL1基因CDS区及其编码蛋白的特性和功能。结果显示,pc DNA3.1-3HA-c BMAL1真核表达载体构建成功,将该质粒转染至HEK293T细胞后,成功实现了BMAL1在m RNA和蛋白水平的过表达;牛BAML1基因与绵羊、山羊同源性最高,BMAL1蛋白为不稳定蛋白,其上不存在...     

梅花鹿胸腺素β4基因真核表达载体的构建及鉴定

为了构建梅花鹿胸腺素β4(Tβ4)基因真核表达载体,使用TRIzol法提取梅花鹿鹿茸总RNA,RT-PCR方法特异性扩增梅花鹿Tβ4基因,目的基因插入真核表达载体VR1012构建表达质粒,将质粒瞬时转染到293T人胚肾细胞系,使用Western blot和免疫荧光方法检测目的基因的表达。结果显示:克隆得到的梅花鹿Tβ4基因长度为135 bp,编码44个氨基酸,成功构建真核表达载体VR1012-Tβ4-HA,转染后梅花鹿Tβ4在293T细胞中表达,而且主要表达在细胞浆中。本试验为进一步研究Tβ4在鹿茸生长中的作用奠定了基础。     

紫花苜蓿蓝光受体CRY2B过表达载体构建及转化

短日照是影响苜蓿秋眠性的主要因素,即光周期效应。根据转录组测序的结果,对主要的蓝光受体隐花色素CYR2 B基因和苜蓿秋眠性之间关系的研究可以从光受体途径来揭示苜蓿秋眠性调控机制,本试验首先克隆紫花苜蓿1级品种‘驯鹿'隐花色素CRY2B基因的完整开放阅读框(696~2553 bp),设计1对含有酶切位点的特异性引物CRY2 B-F,CRY2 B-R,通过多次酶切和连接,将克隆目的片段连接到植物表达载体p CAMBIA3301上得到重组载体p CAMBIA3301-CRY2B,成功地构建了紫花苜蓿CRY2B的过表达载体,并利用农杆菌介导p CAMBIA3301-CRY2 B成功转化苜蓿植株,为进一步研究CRY2 B调控苜蓿秋眠性分子机制奠定基础。     

野桑蚕CYP305B1V1基因的组织表达特异性初探

抽提不同处理的野桑蚕各组织总mRNA,利用地高辛标记的野桑蚕CYP30581V1的cDNA基因作为探针,通过点杂交方 法研究野桑蚕CYP3051B1基因的组织表达特异性。实验结果显示,CYP30581V1基因在氟化物诱导后的野桑蚕中肠、脂肪体、马氏管、体壁 中有特异性转录。     

梅花鹿天然Toll样受体9基因克隆与序列分析

Trizol法提取梅花鹿肝脏总RNA,采用ORF两端兼并引物,RT-PCR方法克隆梅花鹿天然Toll样受体9基因（TLR9）并进行系统的生物信息学分析。RT-PCR结果显示,梅花鹿TLR9基因的mRNA长4 043bp,含有800bp左右的5’UTR,完整ORF编码1 081个氨基酸（GenBank序列号为：HQ260632）。同源性分析显示梅花鹿TLR9基因编码区与其他物种高度同源,但5’UTR区存在基因结构的变异。功能结构域分析显示不同物种间TLR9结构域相对保守但也存在细微差别,结构域的差别导致梅花鹿TLR9蛋白胞外区马蹄形弧顶内侧空间结构由人类TLR9蛋白的弧形改变为梅花鹿TLR9蛋白的三角形。进化分析显示TLR9基因分子进化关系与物种间真实进化相一致。     

梅花鹿colX基因的克隆及原核表达

提取健康梅花鹿鹿茸肥大软骨细胞总RNA,以RT-PCR获得colX基因2 038 bp的完整编码序列,将其克隆入载体pMD18-T中,经限制性内切酶和质粒PCR分析,并测序证实的阳性重组子与表达载体pET-28a( )连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。以IPTG诱导,经SDS-PAGE及Western-blot分析表明,获得相对分子质量为65 000的colX蛋白表达带,与预期相符,表明成功获得梅花鹿colX基因蛋白。     

细胞周期蛋白D1在梅花鹿茸角中的表达

以梅花鹿为研究对象,通过原位杂交方法对细胞周期蛋白D1（cyclin D1）在梅花鹿茸角中的表达进行了研究。结果显示,cyclin D1在梅花鹿茸角表皮层内表达极少,在茸角真皮层、间充质层及软骨层等处均有表达,但在表达强度上存在差异。在真皮层中,cyclin D1在真皮成纤维细胞中有较强的表达,在鹿茸间充质细胞中也有少量cyclin D1的表达,在鹿茸软骨层中,cyclin D1在软骨细胞中的表达量非常高,主要表达在增殖区的软骨细胞中。结果表明,cyclin D1可能在梅花鹿茸角再生过程中起重要的调控作用。     

双阳梅花鹿IGF1基因多态性与产茸性状相关分析

以梅花鹿的胰岛素样生长因子-1(Insulin like factor-1,IGF1)作为候选基因,分析该基因对梅花鹿产茸性状的影响。利用PCR-SSCP技术检测双阳梅花鹿群体64个个体IGF1基因多态性,并将该位点多态性与双阳梅花鹿产茸性状间的相关性进行了分析。结果表明:在IGF1基因824 bp处TC突变;AB基因型在产茸重和主干围度显著高于AA型和BB型(P0.05)。在IGF-I基因对双阳梅花鹿产茸量和主干围度有一定影响。     

Sex determination based on fecal DNA analysis of the amelogenin gene in sika deer (Cervus nippon)

A sex determination method using DNA extracted from feces has been developed for sika deer (Cervus nippon). We determined a partial sequence of the amelogenin gene of sika deer, which exists on both X and Y chromosomes with a deletion region on the Y chromosome. Based on the sexually dimorphic sequences, we designed a pair of primers which could amplify DNA fragments the lengths of which are different between males and females. PCR products were detected in 34 out of 37 fecal samples collected from captured deer and the sexes estimated by the present method were perfectly matched with the actual sexes.     

Bcl-2在梅花鹿茸角中的表达

鹿茸角是哺乳动物唯一的失去后还能完全再生的器官,人们对鹿茸角再生的分子机理了解甚少。本试验以梅花鹿为研究对象,通过原位杂交方法对Bcl-2在梅花鹿茸角中的表达进行了研究。结果显示,Bcl-2在梅花鹿茸角表皮层内表达甚微,在茸角真皮层、间充质层及软骨层等处均有表达,但在表达强度上存在一定差异。在真皮层中,Bcl-2在真皮成纤维细胞中有较强的表达,在鹿茸间充质细胞中也有少量Bcl-2的表达;在鹿茸软骨层中,Bcl-2在软骨细胞中的表达量很高,主要表达在增殖区的软骨细胞中。这表明Bcl-2可能在梅花鹿茸角再生过程中起重要的调节作用。     

Determination of nucleotide sequence of SRY gene in sika deer (Cervus nippon)

The aim of the present study was to determine the whole nucleotide sequence of the open reading frame of the sex‐determining region Y (SRY‐ORF) in wild sika deer. The SRY gene of wild sika deer was obtained by polymerase chain reaction (PCR) with DNA from blood samples. The whole nucleotide sequence of the SRY‐ORF in wild sika deer consisted of 687 bp and encoded 229 deduced amino acids. In comparison with the bovine SRY gene, the percentage of nucleotide sequence homology was 91.0% in the overall ORF, and those of the N‐terminal, high mobility group (HMG) box, and C‐terminal regions within ORF were 88.9%, 96.2% and 87.9%, respectively. The nucleotide sequences of sika deer SRY‐ORF characterized in the present study can be used for phylogenetic analysis or sexing in wild sika deer.     

北方三省区梅花鹿间布鲁氏菌病的流行病学调查

为了摸清布鲁氏菌病在我国北方吉林、黑龙江、内蒙古(东北部)三省区的流行、分布、危害程度等情况,在本调查中,以富有代表性的12个梅花鹿场共1014份血清样品作为研究对象,进行血清学(ELISA)检测,以期进一步为检疫、防疫部门制定防制措施提供科学的理论依据,以确保养鹿业的健康发展。     

犬新孢子虫AMA1基因的生物信息学分析及原核表达载体构建

为了解新孢子虫AMA1基因的生物信息学特性,并构建重组原核表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。本试验对牛源犬新孢子虫吉林株AMA1基因进行分子克隆,利用生物信息学软件对该基因进行编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析,并将该基因片段亚克隆至原核表达载体p GEX-4T-1,构建了重组表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。结果显示,克隆的Nc AMA1基因片段长1 695 bp,与GenBank(AB265823.1)上发表的基因序列同源性99.9%;Nc AMA1基因编码蛋白等电点为5.43,在其N端及C端分别存在一个跨膜区,为不溶性蛋白,且Nc AMA1蛋白抗原指数较高,有潜在疫苗研究价值。     

梅花鹿鹿茸角生长顶端的组织结构

利用光镜和透射电镜对梅花鹿鹿茸角生长顶端的组织结构进行了观察.结果显示,梅花鹿鹿茸角生长顶端分皮肤层、间充质层、前成软骨层、过渡层和软骨层.间充质层细胞形态均一,细胞体积较小,呈梭形,细胞核呈椭圆形,核仁明显,胞质内细胞器含量极少,呈典型的幼稚性细胞形态.前成软骨层内有前成软骨细胞,前成软骨细胞体积较闻充质层细胞大,呈长椭圆形,细胞核呈圆形或椭圆形,有1～2个核仁,胞质内出现较多的粗面内质网及多聚核糖体.过渡层细胞成分多样,包括前成软骨细胞和成软骨细胞;成软骨细胞体积较前成软骨细胞大,胞质内的粗面内质网和高尔基体进一步发育.软骨层内含大量软骨细胞,软骨细胞的形态极不规则,核膜也不规则,胞质内见有粗面内质网、高尔基体、游离核糖体和脂滴,线粒体极少.