H9N2亚型流感病毒血凝素受体结合区定点突变株拯救及其受体亲和性鉴定

利用重叠PCR技术对H9N2亚型流感病毒Y280亚系毒株A/Chicken/Jilin/DH102/2012(H9N2)的血凝素受体结合区220-loop中相对保守的226位和227位进行了氨基酸置换,并通过反向遗传技术拯救了定点突变病毒。固相酶联试验结果显示:226位为L时,病毒偏嗜结合人型受体;226位为Q时,病毒偏嗜结合禽型受体;226位为M时,病毒同时具有与2种类型受体结合的能力,但偏嗜结合人型受体;227位为Q或M时,病毒均偏嗜结合人型受体。因此,相比于227位,Q226L突变足以改变病毒的受体偏嗜性。由于近年来90%以上的H9N2病毒分离株HA226位氨基酸都是L,推测226L是H9N2病毒感染哺乳动物的重要位点。     

应用TaqMan荧光定量PCR检测H3N8亚型马流感病毒

为建立马流感病毒(ETV)的检测方法,本试验针对H3N8亚型ETV血凝素(HA)基因高度保守序列设计并合成了2对引物和1条TaqMan荧光探针,建立了TaqMan荧光定量PCR方法.经用TaqMan荧光定量PCR、RT-PCR和病毒分离方法分别检测新疆等省135份疑似EIV马鼻拭子样品,其结果表明:3种方法的马流感检出率分别为54.07%、37.78%、0.89%;TaqMan荧光定量PCR可检出马流感病毒基因组RNA的灵敏度可达10拷贝/反应.而且与其他马呼吸道病毒均无交叉反应,具有良好的特异性、敏感性和重复性.该方法为H3N8亚型马流感的早期诊断及分子流行病学调查等提供了一种新的快速、准确的定量检测技术.     

甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测甲型H1N1流感病毒[Influenza A(H1N1)pdm09]的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因保守序列,设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,采用实时荧光定量PCR技术检测甲型H1N1流感病毒。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-HA标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,敏感性可达50 TCID50。本研究中,甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法与经典H1N1、类禽H1N1、类人H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒无交叉反应。结果表明,该方法可以在人类和动物间有效地检测甲型H1N1流感病毒。     

新型猪源H1N1流感病毒的分离鉴定及在实验条件下气源性传播的特点

新型猪源性H1N1流感病毒能引起人和猪的呼吸道传染性疾病,自2009年4月起在全球范围内暴发,引起广泛的关注和研究,本试验拟对其分离株的气源性传播特点进行研究。2011年1月,华东某地区出现流感疫情,本研究从病死猪的鼻腔棉拭子和肺脏中分离到1株新型猪源性H1N1流感病毒A/swine/Shandong/07/2011;用荧光定量PCR方法检测发病猪场舍内、外的空气样品中病毒含量;建立气溶胶传染模型来分析该株病毒在实验条件下气源性传播的特点。结果显示:猪舍内空气样品的阳性率为26.10%,病毒含量在3.14～5.72log10copies.m-3空气之间;舍外下风向10m处空气样品的阳性率为40.70%,病毒含量在2.24～3.77log10copies.m-3空气之间;在传染模型中,A/swine/Shandong/07/2011能够造成气溶胶感染组试验猪的感染,但感染率比直接接触组低。研究表明,A/swine/Shandong/07/2011株具有形成病毒气溶胶的能力,在实验条件下能够引起气源性感染。     

A型猪流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据WHO推荐的检测A型猪流感病毒的引物和探针序列,建立了A型猪流感病毒实时荧光定量PCR检测方法。使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,检测结果表明,该方法的敏感性可达100拷贝/25μL反应体系,显示出良好的敏感性和重复性,临床上已用于实验室鼻拭子样品的检测,并成为一种快速定量检测A型猪流感病毒的方法。     

H3N8亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立简便、快速检测H3N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的方法,本研究根据H3和N8亚型AIV的HA和NA基因保守序列,设计合成了2对特异性引物和2条Taq Man探针,通过优化反应条件建立了H3N8亚型AIV一步法实时荧光定量RT-PCR。结果表明:该方法敏感型好,对H3N8亚型AIV检测敏感性达100个模板拷贝数。该方法特异性强,仅对H3和N8亚型AIV检测为阳性;应用该方法对96份临床样品进行检测,结果与病毒分离鉴定结果一致。因此,本研究建立的H3N8亚型AIV一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法具有简便、快速、敏感和特异等优点,可为H3N8亚型AIV感染的有效防控提供技术支撑。     

马流感病毒A/Equine/Huabei/01/07(H3N8)对灵缇犬的实验性感染

为了解灵缇犬对马流感病毒A/Equine/Huabei/01/2007(H3N8)的易感性,将马流感病毒培养液以1.0 mL(含105.7EID50)经静脉途径接种4条灵缇犬,另以2.0 mL(含2×105.7EID50)经滴鼻、点眼方式接种3条灵缇犬。采用临床症状和病理学观察、免疫酶组织化学染色技术、病毒分离、HI抗体检测和流感病毒受体类型检测技术,对病毒在灵缇犬体内的感染情况进行了系统研究。结果表明,感染的7条犬在整个试验观察期间体温等临床指标均无异常变化,未见明显的肉眼和组织学病变。感染后5 d,4条感染犬的气管、支气管和细支气管上皮细胞内流感病毒M蛋白均为阳性,1条犬的咽拭子病毒分离结果为阳性,1条犬的马流感病毒H3亚型HI抗体阳性。感染后14d,剩余3条感染犬中有2条犬马流感病毒H3亚型HI抗体呈阳性。试验证明,目前流行的A/Equine/Huabei/01/2007(H3N8)病毒可以感染灵缇犬,但不导致灵缇犬出现明显的临床症状。灵缇犬的喉头、气管上皮细胞具有与马流感病毒结合的SAα2,3 Gal受体。     

马流感病毒（H3N8亚型，Huabei株）对马的致病性研究

为研究从华北地区分离的H3N8亚型马流感病毒（Huabei株）对马的致病性,分别用E2、E3、E4、E5及E10代病毒液人工感染健康马,比较了不同代次毒株对马的致病性差异.研究表明,E2、E3代病毒以10^7.2～ 10^7.4EID50剂量经喷雾途径可使12 ～ 18个月龄的马出现持续性发热、咳嗽和流浆液性鼻液等典型马流感症状;同样剂量的E4、E5和E10代病毒感染马匹后仅表现为流浆液性鼻液.本研究确定了马流感病毒Huabei株的感染剂量及代次,为马流感灭活疫苗效果评价奠定了实验感染模型基础.     

H5N1虎源流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及临床应用

根据本室分离获得的虎源H5N1流感病毒的HA基因序列测定结果,结合GenBank中报道的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,利用Primer5·0引物设计软件和BLAST软件程序设计出特异性扩增引物。采用成本较低、不需要特异探针引物、优化周期短,能区分病毒变异株的SYBRGreenI随机掺入法建立定量PCR反应体系,并对反应条件进行优化。试验结果表明应用该方法对虎源H5流感病毒的检测具有高度的特异性,检测的灵敏度为101~102拷贝数。对20份病死老虎临床病料和24份人工感染的小鼠脏器病料用荧光定量RT-PCR方法、常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行检测,荧光定量RT-PCR方法检测结果略高于常规RT-PCR方法,但与病毒分离方法结果相一致。这说明荧光定量RT-PCR方法可以对临床上H5N1虎源流感病毒检测提供参考。     

甲型H1N1流感病毒株的分离鉴定以及PR8株的相关基因对重组病毒增殖能力的影响

为分离流感病毒,本研究将疑似甲型流感患者的咽喉拭子接种SPF鸡胚尿囊腔,经检测收获的鸡胚尿囊液具有血凝活性.采用流感病毒通用引物进行PCR扩增出8个基因节段,经测序与GenBank中登录的序列比对后确定该病毒株为2009年爆发的甲型H1N1流感病毒,并命名为A/Harbin/LM/2009 (H1N1),简称LM株.由于LM分离株在鸡胚中增殖能力比较弱,为提高其在鸡胚中的增殖能力,我们利用反向遗传技术将LM株的HA和NA基因与高增殖特性的人流感病毒细胞高产株PR8的另外6个节段进行“6+2”重配,获得拯救病毒,但该重配病毒血凝价并未显著提高.为进一步鉴定影响病毒增殖能力的基因,本研究将LM株所有节段以“7+1”的方式逐一与PR8的7个片段搭配构成完整的流感病毒基因组,分别得到8个重配病毒.结果显示分离株的PB1、PA、HA基因显著降低了重配病毒在鸡胚细胞中的增殖能力.     

Detection of expression of influenza virus receptors in tissues of BALB/c mice by histochemistry

Infection of host cells with the influenza virus is mediated by specific interactions between the viral hemagglutinin and its cell receptor, oligosaccharides containing sialic acid (SA) residues. Avian and human influenza viruses preferentially bind to α-2, 3-linked and α-2, 6-linked sialic acids, respectively. Therefore, differential expression of these receptors may be crucial to influenza virus infection. To date, the distribution of these two receptors has never been investigated in the tissues of BALB/c mice, which is the routine animal model for influenza research. Here, the expression pattern of alpha-2,3 and alpha-2,6 sialic acid-linked receptors in various organs (respiratory tract, gastrointestinal tract, brain, cerebellum, spleen, liver, kidney and heart) of BALB/c mice were determined. Histochemical staining of mouse tissue sections was performed by using biotinylated Maackia amurensis lectin II (MAAII), and Sambucus nigra agglutinin (SNA) were performed to detect the alpha-2,3 and alpha-2,6 sialic acid-linked receptors, respectively. The results showed that the alpha-2,3 and alpha-2,6 sialic acid-linked receptors were both expressed on trachea, lung, cerebellum, spleen, liver and kidney. Only the epithelial cells of cecum, rectum and blood vessels in the heart express the alpha-2,6 sialic acid-linked receptors. The distribution patterns of the two receptors may explain why this model animal can be infected by the AIV and HuIV and the pathological changes when infection occurred. These data can account for the multiple organ involvement observed in influenza infection and should assist investigators in interpreting results obtained when analyzing AIV or HuIV in the mouse model of disease.     

Cross-clade protection against HPAI H5N1 influenza virus challenge in BALB/c mice intranasally administered adjuvant-combined influenza vaccine

The avian H5N1 influenza virus has the potential to cause a new pandemic. The increasing number of recent outbreaks of highly pathogenic avian influenza H5N1 in birds and humans emphasizes the urgent need to develop a potent H5N1 vaccine. Here, we studied the immunogenicity and protective effect of a vaccine prepared from H5N1 inactivated whole virus. This vaccine was intranasally co-administered in mice with phosphate buffered saline, recombinant cholera toxin B subunit (rCTB), cholera toxin (CT), rCTB containing a trace amount of holotoxin (rCTB/CT), polyinosinic:polycytidylic acid double-stranded RNA (polyI:C), or MF59 as an adjuvant. Intranasal administration of H5N1 inactivated whole virus vaccine with rCTB, CT, rCTB/CT, polyI:C, and MF59 elicited an immunological response with both secretory IgA (sIgA) in nasal, lung, and vaginal lavage, and IgG antibody in serum, showing protective immunity against lethal H5N1 infection. Cross-clade protection was also observed in animals immunized with a vaccine derived from Anhui/01/2005(H5N1) with rCTB, CT, rCTB/CT, polyI:C, or MF59 as adjuvants that were subsequently challenged with the A/OT/SZ/097/03 influenza strain.     

Bovine leukaemia virus envelope peptides cause immunomodulation in BALB/c mice

Immunomodulatory activity of two bovine leukaemia virus envelope (BLVEnv) derived peptides were examined in BALB/c mice. One is peptide homologous to CKS-17 which is known as a 17-amino acid peptide derived from p15E of feline leukaemia virus (CKS-17/BLV), and the other is an 18-amino acid synthetic peptide of BLV Env 61-78 (pep61). Priming with CKS-17/BLV in vitro, as well as CKS-17, significantly suppressed the mitogen-induced proliferative responses of spleen cells in naive BALB/c mice. In addition, priming of spleen cells with pep61 in vitro and in vivo resulted in suppression of lipopolysaccaride-induced B-cell proliferative response. This suppression was partially due to the basic amino acid sequence in the peptide because if the pep61-derived peptide lacking Arg was used, this inhibitory activity was partially restored. In contrast, pep61 enhanced both concanavalin A-stimulated proliferative response and IL-2 production. These findings showed that pep61 may contribute to the modification of the host immune responses in the course of BLV infection.     

重组高繁殖力疫苗株H5N2(H5/PR8)病毒的制备和鉴定

作为禽流感疫苗株,不但要求其具有良好的免疫原性,而且要求在生产中具有良好的生长特性,现用的A/Turkey/England/N28/73(H5N2)疫苗株,血凝价28,生长滴度较差.本研究利用自然重组法,预制备一株高繁殖力的预备疫苗株,使它的表面基因血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)来源于A/Turkey/England/N28/73(H5N2)毒株,并使其保持原有的良好的免疫原性,内部基因来源于流感病毒PR8,A/Puerto Rico/8/34(H1N1)毒株,并使其重组病毒赋有了流感病毒PR8高繁殖力的特性.实验结果表明,已获得一株高繁殖力的重组流感病毒H5/PR8,血凝价达到211,生长繁殖特性明显增强.抗原性分析显示,H5/PR8重组病毒与亲本毒株H5N2抗原性无明显差异;致病性分析发现,H5/PR8重组病毒的致病能力较亲本毒株H5N2有明显下降.这为疫苗株的改良奠定了坚实的基础,对禽流感灭活疫苗的生产具有重大意义.     

鸭源H5N5和H5N1亚型禽流感病毒BALB/c鼠感染试验

比较鸭源H5N5亚型禽流感病毒(A/Duck/Changchun/01/2010)和鸭源H5N1亚型禽流感病毒(A/Duck/Liaoning/N/2011)对BALB/c鼠的致病性。以106EID50/50μL剂量鼻腔感染6周龄BALB/c鼠,攻毒后3,5,7,10,14 d取小鼠的肺、脑和肝脏,处理后接种10日龄SPF鸡胚做病毒回收试验,取死亡鸡胚的尿囊液进行RT-PCR检测;分别取接种病毒后5 d小鼠的脑、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏进行病理组织学检测。结果显示,小鼠接种H5N5和H5N1亚型禽流感病毒后,均无明显的临床症状,肝脏中分别于接种后3,5 d分离到病毒,肺脏中于接种后5 d分离到病毒,脾脏、肾脏和粪便中均未分离到病毒。病理组织学检测发现,病毒对小鼠的脏器组织产生了不同程度的病理损伤,以肺脏、脑和肝脏较为明显,且H5N1亚型禽流感病毒引起小鼠脑和肝脏的病理损伤比H5N5亚型更严重。这表明2株鸭源禽流感病毒对小鼠均有一定的致病性,且H5N1亚型强于H5N5亚型。     

鸭源H10亚型禽流感病毒血凝素基因的序列分析及其致病特性

采用血清学试验和RT-PCR方法从华东地区家养水禽中分离鉴定出多株H10亚型禽流感病毒，对其中1株A／Duck／Yangzhou／502／2003（简称Dk／YZ／502／03）的血凝素（HA）基因进行了序列测定，并与GenBank中登录的其他序列进行了比较。结果显示，Dk／YZ／502／03株血凝素基因与哺乳动物水貂分离株A／Mink／Sweden／84（H10N4）的同源性最高；其推导的氨基酸剪切位点序列为P-E-I-M-Q-G-R，为典型低致病性禽流感病毒的特征序列，这与该毒株对SPF鸡和BALB／c小鼠的低致病特性相吻合。     

牛miR-29b影响牛病毒性腹泻病毒感染BALB/c小鼠的作用

前期研究发现高表达miR-29b能显著抑制牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)在体外的复制,而miR-29b过表达是否影响BVDV在体内的复制尚未见有报道。研究设计扩增牛pre-miR-29b基因片段的引物,以MDBK基因组为模板,PCR扩增pre-miR-29b并克隆至慢病毒载体pLL3.7。将阳性质粒pLL3.7-pre-miR-29b与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装慢病毒并测定慢病毒滴度,同时包装pLL3.7空质粒的慢病毒作为阴性对照。将4～5周龄BALB/c小鼠随机分成5组,每组6只,连续2次尾静脉注射2.5×10~7 IU慢病毒悬液pLL3.7-pre-miR-29b或pLL3.7,并于慢病毒注射后96 h通过滴鼻途径攻毒BVDV毒株NADL(1.68×10~5 TICD_(50)/只),于攻毒后不同时间(0,2,4,10,15 d)处死BALB/c小鼠,采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、小肠和血液,提取总RNA,使用荧光定量RT-PCR检测不同组织中BVDV拷贝数;同时制备病理组织切片观察各组织病变情况。结果显示,成功构建pLL3.7-pre-miR-29b质粒;成功包装pLL3.7-pre-miR-29b和pLL3.7慢病毒;使用荧光定量RT-PCR检测发现,pLL3.7-pre-miR-29b感染能显著性降低BVDV拷贝数;与pLL3.7-pre-miR-29b感染的处理组相比较,pLL3.7感染的对照组中各组织病变情况较为严重。结果表明,BALB/c小鼠体内过表达miR-29b能明显抑制BVDV的复制,减轻BVDV感染造成的病变,为以后研发抗BVDV的有效策略和方法提供了理论依据。     

BALB/c小鼠结肠癌皮下转移模型的建立

体外培养人结肠癌细胞株HCT-8,将2×107个/mL人结肠癌细胞(HCT-8)悬液0.2 mL接种于BALB/c小鼠皮下,记录荷瘤生存时间,观察接种瘤生长及转移情况,死亡后解剖并做病理检查.结果显示,皮下转移发生率为94.00%(47/50),淋巴结转移率为96.00%(48/50).荷瘤鼠平均生存时间(60.20±7.60)d,病理结果提示,转移部位肿瘤细胞与接种部位肿瘤细胞结构相似,符合低分化腺癌的特征.本试验成功建立了小鼠结肠癌皮下转移动物模型.为结肠癌的相关研究提供参考.     

猪圆环病毒2型感染裸鼠及BALB/c小鼠的研究

用猪圆环病毒2型（PCV2）经腹腔注射BALB/c小鼠及裸鼠各15只,每隔2周1次,共感染3次.BALB/c小鼠初次、再次感染后均未出现明显的临床症状,仅有2只小鼠出现病理变化;从血清中可检测到PCV2核酸及其ORF2抗体;同时淋巴细胞增殖反应显著增强,NK和CTL细胞杀伤率显著升高;CD4^＋、CD8^＋、CD3^＋T淋巴细胞及CD19^＋B淋巴细胞数量显著减少.裸鼠也未出现明显的临床症状,从血清中可检测到PCV2核酸,但未检测到PCV2 ORF2抗体;除NK细胞杀伤率显著升高外,其余免疫学指标无显著改变.结果表明,BALB/c小鼠比裸鼠对PCV2易感,各项免疫学指标变化与PCV2感染猪一致,但不表现临床症状,仅个别BALB/c小鼠出现病理变化,说明BALB/c小鼠对PCV2不如猪易感.