猪囊尾蚴头节单克隆抗体的制备及特性鉴定

为制备抗猪囊尾蚴头节单克隆抗体(MAb),本研究采用纯化的猪囊尾蚴头节(Cysticercus Cellulosae Scolex)作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术,获得3株分泌抗猪囊尾蚴头节MAb的杂交瘤细胞系(分别命名为2C6、3A5和4G10)。对这3株MAb进行生物学特性鉴定,其染色体平均记数为92±10对,经间接ELISA检测腹水效价分别为1:12800、1:6400和1:25600。亚类鉴定证实,这3株亚类均为IgG1型。Westernblot检测表明,3株纯化的MAb均可与猪囊尾蚴头节抗原发生特异反应;而与猪囊尾蚴囊壁和囊液抗原均不发生反应。本研究获得的3株MAb为猪囊尾蚴病免疫学诊断研究奠定技术基础。     

抗旋毛虫P53ES蛋白单克隆抗体的制备

为制备抗旋毛虫的单克隆抗体(MAb),以旋毛虫P53ES基因的重组蛋白免疫BALB/c鼠,经ELISA筛选和有限稀释法克隆,得到2株能稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株.亚类鉴定2株MAb均属IgM亚类,其轻链均为κ链;腹水效价均达到1:104以上;Western blot证实2株MAb均能与约53 ku处的ES抗原反应,出现特异性条带;杂交瘤细胞株连续传代,细胞生长良好,效价稳定;所得MAb与隐孢子虫、猪鞭虫、猪囊尾蚴囊液抗原、多头蚴囊液、日本血吸虫抗原均无交叉反应.抗旋毛虫P53ES蛋白的MAb的制备,为旋毛虫病的研究和研制旋毛虫病诊断试剂盒奠定了基础.     

胎儿弯杆菌表面蛋白SapA抗原单克隆抗体的制备

用原核表达的重组胎儿弯杆菌毒力因子表面蛋白(rSapA-N)免疫小鼠,采用细胞融合技术,共获得2株抗rSapA-N的单克隆抗体(MAb),经Ⅰg亚类鉴定,均为ⅠgG1,轻链为K链;Western blot证实这2株MAb均能与rSapA-N发生特异性反应,而与其它蛋白则不发生反应;以这2株MAb的杂交瘤细胞制备腹水,效价达到1:100 000和1:60 000.本研究制备的MAb,为研究和检测胎儿弯杆菌提供了一种重要的手段.     

抗牛边缘无浆体MSP5单克隆抗体的制备

为制备抗牛边缘无浆体膜表面蛋白(MSP5)单克隆抗体(MAb),以原核表达的重组MSP5蛋白(rMSP5)免疫BALB/c鼠,应用常规杂交瘤技术获得2株能稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株(1D8和2F3).间接ELISA检测腹水效价分别为5.49×105和7.83×104,亚类鉴定其重链为分别为IgG2b和1gG2a,轻链均为K型;ELISA叠加试验表明这2株MAb识别的抗原位点相同或相近;Western blot结果显示2株MAb均能与rMSP5发生反应.特异性抗MSP5的MAb的获得,为牛边缘无浆体检测奠定了基础.     

抗猪附红细胞体单克隆抗体的制备

以纯化的猪附红细胞体免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并用间接ELISA方法进行筛选,经过间接ELISA方法、免疫印迹和间接免疫荧光试验进行鉴定,共获得5株分泌抗猪附红细胞体单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1H1、1H2、3A5、5B1和7E11,其单抗亚类鉴定分别属于IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2b和IgG2b。这5株McAb均能与猪附红细胞体全菌蛋白发生特异性反应,而不与猪肺炎支原体、猪链球菌、大肠杆菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒发生反应,并且1H1、3A5和5B1能识别同一抗原位点,1H2和7E11识别另一抗原位点。     

抗猪SIgA SC片段单克隆抗体的制备及鉴定

为获得抗猪分泌型IgA(SIgA)的单克隆抗体(MAb),本研究以纯化的SIgA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出1株稳定分泌抗SIgA SC片段的杂交瘤细胞株,命名为2F9。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶200和1∶16 000。Western blot鉴定显示该MAb能够识别天然SIgA蛋白;IFA显示该MAb可以识别真核细胞表达的SIgA SC蛋白。抗猪SIgA SC片段的MAb制备,为建立一系列猪消化道病原的特异性SIgA诊断方法及研究黏膜免疫提供了重要工具,具有广阔的应用前景。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的特异性单克隆抗体(MAb),用含有BVDV E2基因的真核表达质粒pcDNA-E2免疫4周龄～6周龄BALB/c鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以BVDV作为抗原建立间接ELISA筛选及4次连续克隆获得3株能稳定分泌抗E2MAb的杂交瘤细胞系,分别命名为2E2、3D12、4D6。MAb亚类鉴定表明,2E2和4D6为IgM类,3D12为IgG2a亚类,轻链均为κ链。经western blot和间接免疫荧光检测证明3株MAb针对E2的构象表位,并且3D12株MAb能与BVDV及猪瘟病毒(CSFV)结合,2E2和4D6MAb只能与BVDV结合。     

抗鹿源牛病毒性腹泻-粘膜病病毒特异性单克隆抗体的制备与鉴定

为建立鹿源牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)检测方法,本研究制备了抗鹿源BVDV特异性单克隆抗体(MAb)。用纯化的BVDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得2株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株2A3和4B12。通过间接ELISA检测,MAb效价为:上清液及腹水分别为1∶512、1∶640和1∶12800、1∶16000;MAb的亚类鉴定结果表明,2株杂交瘤细胞分泌的抗体亚类均为IgGl亚类;经ELISA测定,2A3和4B12与BVDVC24V株、HCV、BDV、PRV均不发生交叉反应,但与BVDVCCSYD株发生交叉反应;IFA试验结果显示,4B12和2A3与接种BVDVN71株病毒液的细胞反应产生较强的特异荧光;抗原识别位点分析结果表明,2A3和4B12两株MAb所识别的抗原位点相同。这两株MAb的获得为鹿BVDV的检测方法的建立奠定良好的基础。     

沙门菌PhoN蛋白单克隆抗体及其免疫磁珠的制备

为制备针对沙门菌Pho N蛋白的单克隆抗体(MAb)，并以其制备沙门菌的免疫磁珠，本研究构建了重组原核表达质粒p Cold I-pho N和p GEX-6P-1-pho N，利用大肠杆菌系统表达并通过亲和层析纯化了鼠伤寒沙门菌重组蛋白His-Pho N和GST-Pho N，分别作为免疫原和筛选抗原，利用B淋巴细胞杂交瘤技术，经间接ELISA方法筛选获得5株能稳定分泌Pho N蛋白MAb的杂交瘤细胞株，分别为8H2、11E5、4B2、8F2、3B2。采用亚类鉴定试剂盒、间接ELISA和western blot方法分别鉴定各MAb的亚型、效价及特异性结合沙门菌Pho N蛋白的能力，结果显示，5株MAb的亚型均为Ig G2a，测定其效价达1∶4 096 000以上，均能特异性结合His-PhoN和GST-Pho N，而不与His-OmpC、His-OmpF蛋白反应，表明MAb特异性较好。选取4B2 MAb进一步分析其对不同血清型沙门菌和非沙门菌的特异性，western blot结果显示4B2 MAb仅特异性识别不同血清型沙门菌，而不与大肠杆菌、志贺杆菌、空肠弯曲菌和单核细胞增生李斯特菌反应；...     

抗猪细小病毒单克隆抗体的制备

为了建立一种快速准确的猪细小病毒(PPV)病诊断体系,本研究制备了抗PPV的单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株.将PPV免疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇作用下融合,用ELISA方法筛选,得到8株分泌抗PPV MAb细胞株,这8株MAb亚类均为IgG1,轻链均为κ型.交叉实验等特异性分析发现这些MAb只特异地与PPV发生反应,而不与猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)等发生交叉反应.将杂交瘤细胞注射BALB/c小鼠制备的腹水抗体效价介于1:2 560～1:20 480之间.Western blot结果显示,8株MAb中2株针对VP1发生反应,5株针对VP2、VP3发生反应,但其中有1株呈阴性反应,该MAb可能识别的是PPV的构象表位.     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗H5N1禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),本研究以灭活的H5N1亚型A/Chickeen/Guangdong/S2261/2009(H5N1GD261)株免疫4周龄～6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA及HI筛选获得了3株能稳定分泌抗HA的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1A4、2F5和3D3.MAb亚类鉴定表明,2F5为IgM类,其它为IgG2a亚类,轻链均为k链.经血凝抑制检测,3株MAb均能与H5亚型的AIV结合,并具有较好的型广谱性.     

猪NLRP3单克隆抗体制备及其抗原表位的鉴定

为制备猪炎症小体NLRP3的特异性单克隆抗体(monoclonal antibodies, MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NLRP3作为免疫原免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选获得了3株能稳定分泌NLRP3蛋白的杂交瘤细胞株9H5、13E1、15E2,鉴定了抗体亚类,将目的蛋白逐步截短后鉴定出了单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明,MAb 9H5和15E2识别的抗原表位序列在1～57 aa之间,MAb 13E1识别的表位序列在115～186 aa之间。免疫荧光、Western blot和亚类鉴定试验显示,杂交瘤细胞产生的抗体均可与NLRP3及重组蛋白特异性结合,9H5、13E1、15E2的重链亚型均为IgG 2b,轻链分别为λ、λ和κ链。本研究成功制备了猪NLRP3的单克隆抗体,为进一步研究猪炎症小体NLRP3的功能提供工具。     

猪圆环病毒2型Rep’蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备猪圆环病毒2型Rep’蛋白单克隆抗体(MAb),本研究采用淋巴细胞瘤杂交技术制备其MAb,获得了1株能够稳定分泌抗PCV2-Rep’蛋白的杂交瘤细胞株,命名为3D1株。MAb亚类鉴定为IgG1/κ型,腹水效价达1∶819 200。Western blot分析表明,该MAb可与重组杆状病毒表达的PCV2-rRep’和PCV2-rRep蛋白发生特异性反应,具有良好的特异性和反应原性。采用MAb对PCV2感染细胞中Rep’蛋白抗原性进行了鉴定,证明该MAb能够与病毒Rep’蛋白产生特异性反应。采用合成肽扫描法对MAb对应的抗原表位鉴定,其核心序列为61FANFVKKQTFNKV73,位于PCV2-Rep’蛋白的N末端。制备的MAb及其抗原表位鉴定,为该病毒分子生物学及诊断技术的研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗M蛋白单克隆抗体(MAb),本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BALB/c小鼠;以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,得到一株稳定分泌抗M蛋白MAb.MAb亚类鉴定为IgG2b型,轻链为к链,杂交瘤细胞培养上清和诱导的小鼠腹水抗体效价分别为1:3000和1:2×105.Western blot试验表明该MAb能够识别重组及天然的PEDV M蛋白.间接免疫荧光试验表明该MAb能够与PEDV感染的Vero E6细胞产生特异性免疫荧光.     

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体制备及鉴定

为制备鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体(MAb),本研究用纯化的SVCV免疫BALB/c鼠,通过杂交瘤细胞技术,制备2株抗SVCV的MAb,分别命名为2A3和3H7。经间接ELISA检测腹水效价为1:10240和1:12150。亚类鉴定证实,这2株亚类均为IgG1型。经非竞争酶免疫试验测定2A3和3H7的抗体亲和力常数分别为4.86×108L/mol和1.86×109L/mol,3H7相对亲和力高于2A3。MAb 2A3和3H7的饱和度均为1:400,叠加试验所得增值指数为63.2%,大于50%。抗体反应增值结果表明:两株MAb分别针对不同抗原位点。免疫印迹分析检测表明,两株纯化的MAb均可与SVCV抗原发生特异反应。     

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为获得针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)特异性的单克隆抗体(MAb),以纯化的SVCV为抗原,免疫BALB/c小鼠.将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选获得4个能稳定分泌抗SVCV MAb的杂交瘤细胞株;4个杂交瘤细胞制备腹水的MAb效价为1:160 000～1:640 000.亚型鉴定结果表明,这些MAb分属2个亚型(1F1、3E1,IgG2a;3F5、4F9,IgGl),轻链均为K链.Western blot分析显示,MAb1F1、3F5、4F9能特异性地识别SVCV的N蛋白(47 ku),3E1能特异性地识别SVCV的G蛋白(69 ku).采用相加ELISA法对抗原表位分析结果显示,1F1、3F5、4F9可能识别相同的表位,3E1则识别不同的表位.间接免疫荧光试验结果显示4株MAb均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色.这些MAb的制备为SVCV免疫学检测方法的建立奠定了基础.     

禽白血病病毒群特异性抗原单克隆抗体的制备与鉴定

为制备禽白血病病毒(ALV)群特异性抗原的单克隆抗体(MAb),本研究从ALV-J病毒株感染DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出ALV群特异性抗原p27基因,并将其克隆至pMD18-T载体中,酶切鉴定后进行序列测定和分析。最后将p27基因亚克隆至载体pET-30a(+)中,转化受体菌BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测获得融合蛋白。经过western blot检测,表达的蛋白具有良好的反应原性。将纯化的p27蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得5株能稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株。5株MAb与纯化的p27蛋白以及不同亚群ALV可以发生特异性反应。所制备的MAb为禽白血病的诊断方法研究奠定了基础。     

牛副流感病毒3型NP单抗的制备及初步应用

为制备牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的重组NP (rNP)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用以BPIV3为检测抗原的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株稳定分泌抗NP特异性MAb的杂交瘤细胞株(5E5)并制备腹水,采用rNP及BPIV3包被的ELISA效价分别是2×106和1.28×105.间接ELISA、western blot、IFA试验表明该MAb具有良好的反应性和特异性.经抗体亚类鉴定该MAb亚类为IgGl/κ.特异性试验表明该MAb不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒反应.免疫组化试验表明该MAb可以检测BPIV3感染动物体内的病原.该MAb还可用于建立检测BPIV3病原及抗体的诊断方法,同时为研究NP的结构和功能提供了条件.     

单抗捕捉ELISA检测猪附红细胞体血清抗体方法的建立

在制备针对猪附红细胞体病的特异性单克隆抗体的基础上,建立了单抗捕捉快速检测猪附红细胞体病抗体的ELISA方法,并对影响ELISA结果的各项反应条件进行了优化.结果表明,猪附红细胞体腹水单抗的最佳稀释度为1:20 000,猪附红细胞体病抗原工作质量浓度为4.088 mg/L,血清稀释度为1:40,HRP标记的兔抗猪IgG的工作浓度为1:5 000.待检血清和酶标二抗的反应时间均为37℃1 h;底物在室温显色时间为10 min.已建立的ELISA方法与PCR平行检测50份样本,总符合率为92%,表明该方法特异性强、快速、敏感性高.用该法检测了各地采集的171份血清,阳性率为40.4%,与镜检的符合率为59.2%;阴性率为47.4%,与镜检的符合率为66.7%,总符合率为67.3%.     

猪传染性胃肠炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白的单克隆抗体(MAb),试验利用原核表达融合蛋白His-M免疫7周龄雌性Balb/c小鼠,以PK-15细胞培养病毒液作为检测筛选抗原,并采用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果表明:获得2株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株(2G1、2G2),经检测其细胞培养上清液和诱导的小鼠腹水抗体效价分别可达到1∶3 200和1∶1×10~5;连续培养15代及液氮冻存后复苏,抗体效价稳定;单克隆抗体亚型鉴定均为IgG1,轻链均为k链;MAb能够特异性识别TGEV。