组蛋白甲基化和去甲基化研究进展

在真核基因中,组蛋白会发生多种共价修饰,其中组蛋白的甲基化在表观遗传学中起重要作用。不同的甲基化位点产生不同的作用机理,组蛋白H3K9的甲基化与异染色质形成、基因沉默有关;组蛋白H3K4的甲基化与基因转录激活有关;组蛋白H3K36的甲基化与RNAPⅡ有一定的关系。最近首次报道了组蛋白甲基化的可逆性,并发现组蛋白去甲基酶:LSD1和含有Jmjc域的组蛋白去甲基酶。这些去甲基酶可使不同程度甲基化的组蛋白H3K4、K9、K36去甲基化,同时与基因转录存在联系。     

从早期胚胎分离和培养兔胚胎干细胞

采用昆白系小鼠成纤维细胞（MEF）作为饲养层，低糖DMEM 10%NBS 10%FSC 10ng/mLLIF 10ng/mLSCF 0.1mmol/Lβ-巯基乙醇 100IU/mL青霉青 80IU/mL链霉素作培养基，从培养96h的胚胎中分离出1个兔类ES细胞集落，克隆传至4代，悬浮培养的兔类ES细胞团，可出现囊状胚，兔类ES细胞接种在衰老的饲养层上，出现滋养层细胞和上皮样细胞。     

落叶松体细胞胚胎发生过程中DNA甲基化模式变化分析

通过MSAP技术检测落叶松体细胞胚胎发生过程中的DNA甲基化模式变化发现,体细胞胚胎发生的14个时期中,5'-CCGG-3'序列的胞嘧啶上发生重新甲基化事件最多在ABA诱导后的0.5～6h,最少在5～7d的早期单胚阶段;而去甲基化事件发生最多的是5～7d的早期单胚阶段,最少在14～21d的中期单胚到晚期单胚阶段.与原胚...     

兔胚胎干细胞核移植克隆技术

对兔胚胎干细胞核移植过程中受体卵子的去核方法、供核兔胚胎干细胞的预处理及电融合的场强等操作技术进行了比较试验.结果表明,压迫式去核方法的去核有效率达85.71%,略高于注吸式.当电融合场强为1.6或1.8 kV/cm时,重组胚的卵裂率和桑、囊胚率较高,分别达到33.3%和16.67%.在操作液中添加PVA对獭兔干细胞核转入融合与后期囊胚发育均有不同程度的影响,使囊胚发育率显著提高.将11个融合胚及5枚发育囊胚移植到受体兔体内,未发现妊娠现象.     

微滴中胚胎数量对猪孤雌胚早期体外发育的影响

[目的]优化猪早期胚胎培养体系,为单精子显微受精及体细胞核移植等研究提供依据。[方法]以猪的早期孤雌胚胎为材料,分别将人工激活后的70、50、30、15和5枚卵母细胞放入100μlNCSU-23培养液的微滴中进行培养,探讨了胚胎培养数量对猪早期孤雌胚发育的影响。[结果]100μl的培养微滴中培养30、50和70胚胎组,其分裂率分别为64.0%、65.2%和67.1%,显著高于5胚胎组,而与15胚胎组的差异不显著 在囊胚率方面,70胚胎组的最高,为3.0%,与50胚胎组的（1.7%）无显著差异,与5、15和30胚胎组的差异显著 各组的囊胚细胞数之间没有显著差异。[结论]在该研究条件下,当微滴体积为100μl时,培养50~70枚猪孤雌胚胎的效果最好,即,胚胎数∶培养滴体积=（1∶1.43~2.00）。     

牛早期胚胎在不同培养液中体外发育比较

以卵丘/颗粒细胞单层作为共培养饲养层，比较了体外受精胚，卵母细胞孤雌激活胚和体细胞核移植胚在几种培养液中体外发育能力，以期筛选较适合体细胞克隆胚胎的体外培养系统。将体外受精卵分别置5种培养液中培养，囊胚发育率分别为20.43％、24.12％、32.10％、20.29％和29.03％，在CM1和CM2中囊胚的孵化率分别为8.64％和20％，结果表明，在添加10％的FBS时培养效果较好。卵母细胞孤雌激活胚在CM2-CM5中囊胚发育率分别是25.09％、29.84％和29.93％。核移植胚胎在CM3和CM5培养液中囊胚发育率为13.04％和9.26％。表明在共培养条件下CM3和CM5可以用于核移植胚胎的体外培养。     

黄牛孤雌胚胎的体外培养

试验研究了培养液中血清的添加时间和添加浓度及不同培养体系对黄牛孤雌胚胎体外发育潜力的影响.结果表明.黄牛成熟卵母细胞孤雌激活后的第3天添加10%的FBS对孤雌胚的体外发育效果较好;4种培养体系在孤雌激活后的第3天添加10%的FBS.平均囊胚率分别可达46.25%(SOFaa)、43.58%(Crlaa)、40.25%(KSOM)和17.98%(TCM199);TCM199组的囊胚率显著低于其他3组(P<0.05),SOFaa组优于Crlaa和KSOM组,但差异不显著(P>0.05).表现最好的是黄牛成熟卵母细胞孤雌激活后的第3天在SOFaa组中添加10%的FBS,其平均囊胚率可达46.25%.     

猪早期孤雌胚组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化酶基因mRNA表达水平相关性研究

 【目的】 探讨猪孤雌胚早期发育过程中组蛋白H4K5乙酰化水平与组蛋白去乙酰化酶(HDAC1)基因mRNA表达水平之间的关系。【方法】收集早期猪孤雌胚(2-细胞、4-细胞、桑椹胚和囊胚),运用细胞免疫组化和激光共聚焦显微镜,通过检测这些胚胎的相对荧光强度来评判其H4K5的乙酰化水平;运用实时定量PCR的方法检测猪早期孤雌胚发育过程中HDAC1基因mRNA表达的动态变化。【结果】从2-细胞到囊胚开始,其H4K5的乙酰化均在细胞核内表达,且各阶段表达量逐步提高,至囊胚期达最高(分别为1124.77±127.78、1305.81±184.23、1795.19±318.67及2149.63±529.47),差异显著(P＜0.05);从2-细胞到囊胚,其HDAC1基因 mRNA表达逐步降低(分别为1.00±0、0.91±0.009、0.85±0.008及0.67±0.006),各阶段差异显著(P＜0.05)。【结论】从2-细胞到囊胚,其H4K5的乙酰化水平与HDAC1基因mRNA表达水平之间呈负相关。     

影响兔胚胎细胞核移植效率的因素

 对兔胚胎细胞核移植（NT）的有关影响因素进行了系统研究。结果发现电场强度100 V·mm-1，脉冲时间15μs，电脉冲3～4次的融合率显著高于其它组（P<0.05）；融合前激活卵母细胞，分裂率和囊胚率显著高于融合后激活（P <0.05）；当用8～16-细胞胚胎的卵裂球作供核时，卵裂率和囊胚率显著高于致密桑椹胚卵裂球为供核组；当重组胚在含3%发情牛血清（OCS）的TCM199中培养48 h后，转入含10% FCS的TCM199中继续培养，卵裂率和囊胚率显著高于一直在3% OCS或10% 胎犊血清（FCS）中培养的重组胚（P < 0.05）。将22枚2～4-细胞期重组胚移入同期发情的受体母兔输卵管内，34 d后产下NT仔兔1只。结果表明，电融合参数和供体胚胎的发育阶段以及受体卵母细胞的状态对NT效果有显著影响，在NT胚胎的不同发育阶段采用不同的血清种类和浓度可提高其胚胎发育能力。     

组蛋白甲基化对酿酒酵母铁离子代谢平衡基因表达的影响

为了解组蛋白化学修饰在铁离子代谢平衡相关基因表达调控中的作用,在酿酒酵母中通过敲除铁硫簇合成基因YFH1激活铁离子代谢平衡相关基因,并在此基础上敲除组蛋白甲基化酶基因,然后通过RNA测序检测组蛋白甲基化在铁离子代谢平衡相关基因激活中的作用。结果显示,酿酒酵母中组蛋白甲基化的缺失并没有显著影响铁离子代谢平衡通路相关基因的激活,表明组蛋白甲基化在铁离子代谢平衡基因的激活调控中并不是必须的。     

兔胚胎玻璃化冷冻的研究

探讨用玻璃化冷冻法保存兔胚胎的效果．结果表明,兔早期囊胚在0．5M海藻糖（93．8％）溶液中的存活率显著高于0．5M蔗糖组（70．0％,P〈0．05）．对照组与不同浓度甘油处理间兔胚胎存活率均差异不显著（P〉0．05）．分别用不同浓度乙二醇玻璃化冷冻兔胚胎,解冻回收后正常胚胎数和囊胚孵化率,对照组与10％,20%EG组之间均差异不显著（P〉0．05）,但对照组,10％,20％EG组均显著高于30％EG组（P〈0．05）．解冻回收后正常胚胎数体内胚胎组（79．4％）显著高于体外胚胎（54．1％,P〈0．05）,囊胚孵化率2组之间差异不显著（P〉0．05）．缓慢冷冻法与玻璃化冷冻法之间胚胎解冻回收后正常胚胎数和囊胚孵化率均差异不显著（P〉0．05）．     

小鼠孤雌胚胎体外共培养体系的建立

[目的]在输卵管上皮细胞和/或垂体细胞饲养层下培养小鼠孤雌胚胎,探讨促进小鼠孤雌胚发育突破2-cell阻滞的机制,建立完善的培养体系。[方法]复式激活小鼠卵母细胞后分别在不同饲养层的CZB培养液中进行培养,并观察、比较各培养条件下孤雌胚胎的发育情况。[结果]培养至24 h,各组无显著差异,都有较高卵裂率。培养至48 h,2类饲养层细胞下的孤雌胚胎48-cell发育效果好,与单独一类饲养层细胞培养差异显著,与对照组比较差异极显著。培养至96 h,2类饲养层细胞下有49.4%（42/85）孤雌胚胎发育为桑囊胚,与其他各组比较差异极显著。[结论]含有输卵管上皮细胞＋垂体细胞的CZB培养液可有效促进小鼠孤雌胚胎发育突破2-cell阻滞,并进一步提高其发育率。     

组蛋白修饰在水稻中的研究进展

作为表观遗传学研究的重要内容,组蛋白修饰在维持真核生物基因组稳定性、基因表达调控和染色质结构等方面发挥重要作用.水稻是重要的粮食作物,也是科学研究的模式植物.近年来研究发现,组蛋白修饰参与了水稻生长发育、胁迫应答、产量以及品质形成等重要生物学性状的调控.因此,明确组蛋白修饰在水稻中的遗传和调控机制对于水稻遗传改良具有重...     

提高兔核移植胚胎体外发育率的研究

 本研究首先比较了不同培养液维持兔胚体外发育的作用，以及多种卵母细胞去核显微操作的去核效率，建立了高效的体外培养体系及去核方法。然后对16-细胞期卵裂球的细胞周期及核移植（Nuclear transplantation,NT）胚的核质比对发育的影响进行了试验，结果表明：G#-1期NT胚的发育率优于G#-2期NT胚（P<0.01）。当G#-1期NT胚的核质比等于卵母细胞时，78.5%(73/93)可在兔眼球玻璃体液(Rabbit vitreous humor,RVH)中发育至囊胚期。这是迄今为止，在动物胚细胞核移植试验中所获得的最高发育率。     

培养液体积对猪孤雌胚早期发育的影响

为了探讨培养液体积对猪早期孤雌胚发育的影响,旨在优化猪早期胚胎培养体系。试验一、二、三、四分别把30、20、15、10个枚孤雌激活胚放入60,45,30,15,10,5μL(10个胚胎)的培养滴,第48小时观察分裂率,第168小时观察囊胚形成率。结果表明:试验一:30~60μL组囊胚率略高于10~15μL组;试验二:60μL组的囊胚率略高;试验三:各组分裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05),但45~60μL组分裂率和囊胚率比其他组略高;试验四:15μL组分裂率高于45μL组(P<0.05),15μL组囊胚率显著高于5μL组(P<0.05),其余各组差异不显著。由此表明:30枚猪孤雌胚时,胚胎数∶培养滴体积=1∶(1~2)较好;15~20枚猪孤雌胚时,胚胎数∶培养滴体积=1∶3较好;10枚猪孤雌胚时,胚胎数∶培养滴体积=1∶1.5较好。     

IL-1β及其受体在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中的表达定位

为探索正常生理条件下IL-1β和IL1R1参与雌性牦牛生殖调控及早期胚胎发育的生物学作用,试验采集雌性牦牛主要生殖器官(卵泡期:输卵管、卵巢、子宫;黄体期:输卵管、卵巢、子宫;妊娠期:输卵管、卵巢、子宫),并生产孤雌激活胚胎。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测IL-1β和IL1R1 mRNA在组织和胚胎发育过程中的表达;并采用蛋白质免疫印迹(Western-blot,WB)和免疫组织化学方法从蛋白水平分析IL-1β和IL1R1在各生殖器官的表达水平与定位。结果显示IL-1β和IL1R1在牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中均有表达。其中卵泡期输卵管中IL-1β和IL1R1表达均高于黄体期和妊娠期,卵泡期卵巢和妊娠期卵巢中IL-1β和IL1R1的表达高于黄体期,妊娠期子宫中IL-1β和IL1R1的表达高于卵泡期和黄体期,孤雌激活胚胎中IL-1β和IL1R1的表达桑椹胚最高,8细胞次之,2细胞和囊胚期最低。免疫组织化学结果显示IL-1β和IL1R1在输卵管黏膜上皮、卵泡颗粒层、黄体细胞、子宫上皮和子宫腺体均有表达。研究结果表明IL-1β和IL1R1参与牦牛生殖周期和胚胎发育的调控作用,为进一步探究IL-1β和IL1R1的作用机制提供了理论基础,有助于牦牛胚胎体外培养技术的改进。     

颗粒细胞单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响

为优化颗粒细胞单层共培养体系,研究了不同类型、不同种属的颗粒细胞单层及不同时间更换培养单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响.结果表明.就卵裂率、囊胚率和囊胚孵出率而言.壁颗粒细胞单层组与丘颗粒细胞单层组之间无显著差异(P>0.05);来自黄牛、猪和小鼠的颗粒细胞单层在支持黄牛孤雌胚胎体外发育方面无显著差异(P>0.05):就囊胚率而言,共培养的第3天和第6天两次更换单层分别与共培养的第4天更换单层和始终不更换单层的对照组之间无显著差异(P>0.05),但第4天更换单层与对照组之间有显著差异(P<0.05).所以.不同类型和不同种属的颗粒细胞单层都能很好地支持黄牛孤雌胚胎的体外发育.在胚胎的体外发育过程中更换培养单层可以明显提高胚胎的囊胚率和囊胚孵出率,并且在共培养的第4天更换培养单层可以得到较高的囊胚率.