不同氮源对三角褐指藻生长和脂类含量的影响

研究了不同氮源及浓度对三角褐指藻(Phaeodacylum tricornutum)的生长、总脂及脂肪酸组成的影响.结果表明,三角褐指藻在氮源缺乏时生长缓慢,表现出油脂积累的特性.以初始浓度大于3.9 mmol/L的氯化铵作为氮源,可以促进三角褐指藻生物量和油脂含量的同步增长.高浓度的尿素有利于三角褐指藻的生长,但达到8.0 mmol/L时脂肪含量下降.不同浓度硝酸钠都促进三角褐指藻的生长,但不能促进脂肪的积累.脂肪酸组成分析表明,单不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例为45％～50％,受各种氮源变化的影响较小,可为生物柴油提供较好的流动性.氮源的添加有利于二十碳五烯酸(EPA)和多不饱和脂肪酸(PUFAs)的合成,当氯化铵浓度为3.9 mmol/L时,EPA和PUFAs占总脂肪酸的比例达到最大,分别为20.4％和26.7％.     

3种不同来源的三角褐指藻的生长与油脂积累差异

[目的]研究3种不同来源的三角褐指藻的生长与油脂积累差异,为藻种的选择和培养工艺的确定提供参考。[方法]比较不同来源的三角褐指藻QEAC501、QEAC503和QEAC504在实验室条件下的生长与油脂积累能力,以及主要的脂肪酸的碳链组成,[结果]3个三角褐指藻品种在正常的摇瓶批次培养条件下生长速度无明显差异,同时由于营养供应的充足,都不能大量的积累脂类物质;而经过营养缺乏的诱导,3个品种均明显出现大量的脂质尤其是甘油三脂的积累,其中品种间甘油三脂的积累能力有明显差异,脂肪酸链长组成总体上没有明显差异,均以C-16为主。[结论]利用薇藻生产油脂时应注意选择高油脂积累的品种,并在生产过程中设置营养缺乏诱导以提高薇藻的油脂积累。     

三角褐指藻和小球藻藻粉添加对皱纹盘鲍稚鲍生长的影响

【目的】研究微藻添加对皱纹盘鲍稚鲍生长的影响,探索三角褐指藻和小球藻作为稚鲍饲料添加剂的可行性。【方法】在饲料中添加 1%、3% 和 5% 的三角褐指藻和小球藻藻粉,比较各处理稚鲍的生长参数,全组织总抗氧化能力（T-AOC）,超氧化物歧化酶（SOD）、α- 淀粉酶（AMS）、纤维素酶（CL）活性以及内脏囊中细菌、弧菌的数量。【结果】饲料中添加三角褐指藻和小球藻藻粉可显著提高稚鲍壳长,显著降低稚鲍死亡率,其中以 5% 三角褐指藻处理稚鲍的壳长最大（16.38±2.49 mm）,1% 小球藻处理稚鲍的死亡率最低（2.00%±0.67%）。饲料中添加三角褐指藻可显著提高稚鲍体质量、增重率,显著降低饵料系数。养殖 40 d 后,5% 三角褐指藻处理和 5% 小球藻处理的 SOD 活性（12.9±0.75、12.99±0.42 U/mg）均显著高于对照。3%、5%三角褐指藻处理的 T-AOC 活性（1.15±0.03、1.19±0.06 U/mg）显著高于对照。5% 三角褐指藻处理的 AMS 活性（4.92±0.74 U/dL）显著高于对照,各处理间的 CL 活性差异不显著。养殖 40 d 后,5% 三角褐指藻和 5% 小球藻处理稚鲍内脏囊中细菌和弧菌的数量均显著低于对照。【结论】饲料中添加三角褐指藻对皱纹盘鲍稚鲍生长的促进效果优于小球藻,以添加 5% 三角褐指藻的效果最优。     

营养条件对三角褐指藻生长和油脂积累的影响

研究了培养基中添加乙酸钠、尿素以及Fe3+对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)生长和油脂积累的影响。结果表明,培养基中添加乙酸钠作为碳源的兼养生长模式对三角褐指藻的生长和油脂含量的增加有明显的促进作用(P<0.05),在乙酸钠浓度为5.0 g/L时得到最大生物量为1.28 g/L,是对照的1.7倍;而在乙酸钠浓度为0.5 g/L时油脂含量达到最大(28.90%),是对照的1.9倍;培养基中添加适当浓度的尿素作为氮源,可以显著地提高三角褐指藻的生长速率(P<0.05),但对生物量和油脂含量没有显著影响(P>0.05);培养基中Fe3+浓度的增加对三角褐指藻的生长速率、生物量及油脂积累均没有显著影响(P>0.05)。     

△6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物,以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板,通过PCR扩增,克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明,试验得到扩增片段长1148bp,含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接,构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR,为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。     

三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因克隆、过表达载体构建及生物信息学分析

通过RT-PCR的方法克隆三角褐指藻的△5-脂肪酸延长酶基因的cDNA序列,利用双酶切技术构建重组表达载体,并对该基因进行相关的生物信息学分析。结果表明:三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因的cDNA全长为834 bp,编码278个氨基酸,预测的等电点为9.13,理论分子量32 348.91。△5-脂肪酸延长酶基因中存在1个内含子,该酶属于ELO系列延长酶,可能定位于内质网中,包含多个跨膜区域和保守区域。亲缘关系分析表明,三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶与假微型海链藻的亲缘关系最近。试验还成功构建了三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因过表达重组质粒pPha-T1-5e,为下一步三角褐指藻中相关油脂代谢基因的表达和功能验证奠定基础。     

少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达

 【目的】验证少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达情况，为进一步基因工程化生产γ-亚麻酸打下基础。【方法】将少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因和植物表达载体pCPN2301连接，构建重组表达质粒pCPNRAD6，采用农杆菌介导的油菜子叶节转化法，将该基因导入甘蓝型油菜H165，获得转基因植株，最后通过气相色谱检测基因的表达情况。【结果】PCR、GUS组织化学染色和Southern杂交分析结果表明，目的基因已经整合到油菜基因组中，Northern杂交分析进一步表明目的基因在RNA水平获得表达，气相色谱分析检测到转基因油菜叶片中γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成，证明目的基因获得功能表达。同样，用改变少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列的基因RAD6-1所构建的转基因酵母中，也得到类似的结果，而且各种目的脂肪酸的含量均有提高。【结论】初步建立了少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达体系。     

少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达

[目的]验证少根根霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达情况,为进一步基因工程化生产γ-亚麻酸打下基础.[方法]将少根根霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因和植物表达载体pCPN2301连接,构建重组表达质粒pCPNRAD6,采用农杆菌介导的油菜子叶节转化法,将该基因导入甘蓝型油菜H1 65,获得转基因植株,最后通过气相色谱检测基因的表达情况.[结果]PCR、GUS组织化学染色和Southern杂交分析结果表明,目的基因已经整合到油菜基因组中,Northern杂交分析进一步表明目的基因在RNA水平获得表达,气相色谱分析检测到转基因油菜叶片中γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,证明目的基因获得功能表达.同样,用改变少根根霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列的基因RAD6-1所构建的转基因酵母中,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有提高.[结论]初步建立了少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达体系.     

木薯海藻糖-6-磷酸酯酶MeTPP6基因克隆及其表达分析

海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)负责海藻糖生物合成催化反应的最后一步,是植物海藻糖生物合成途径的关键酶。采用RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆了1个TPP基因,命名为MeTPP6,该基因含有1个1 122 bp的开放阅读框,编码373个氨基酸,具有TPP家族保守结构域。系统进化树分析表明,MeTPP6与杞柳和杨树中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性高达89.7%和89.0%。启动子分析表明,MeTPP6含有干旱、低温、热胁迫、激素(如ABA)和光响应等相关元件。荧光定量PCR分析表明,MeTPP6在叶片和叶柄中表达量最低;在须根和储藏根中表达量最高,分别为叶片表达量的4.2倍和4.5倍。而且,MeTPP6基因的表达能被干旱、低温和ABA处理显著诱导。这些结果表明,MeTPP6通过依赖于ABA的信号通路在转录水平参与木薯干旱和低温胁迫,可作为重要候选基因进一步研究其在木薯非生物逆境中的功能。     

高山被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

 将从高山被孢霉中克隆的△6-脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI121连接,构建了重组质粒pBMICL6,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将该基因导入到栽培大豆吉林35、吉林43、吉林47、绥农10、绥农14和黑农37等品种中,获得了一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明,该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。通过气相色谱(GC-MS)对大豆种子进行脂肪酸成分分析,发现转基因大豆产生了γ-亚麻酸,其含量最高     

高温中性蛋白酶基因的克隆及毕赤酵母表达研究

对地衣芽孢杆菌XJT9503高温中性蛋白酶进行了克隆,并在毕赤酵母中进行了表达.以高温中性蛋白酶产生菌地衣芽孢杆菌XJT9503基因组DNA为模板,通过PCR扩增,获得高温中性蛋白酶(Tnp)基因的特异性片段,大小约为1 kb.通过EcoRI、NotI 双酶切后,将该基因连入毕赤表达载体pPIC9K,并整合到毕赤酵母SMD1168基因组中,构建的基因工程菌,进行甲醇诱导表达.结果表明,基因工程菌发酵72 h,有最大酶活,为19 U/mL;酶的最适作用温度为65℃,与原始酶的最适作用温度相符.证明研究成功克隆了高温中性蛋白酶基因,并在毕赤酵母中正确表达.     

烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达

根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列，设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR，扩增出了1条约1．4kh的带，将该片段进行DNA序列测定，其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致，但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，其中一重组子经144h诱导，植酸酶表达量至少为1．25mg／ml，比同类报道的表达量高出60％以上，以植酸钠为底物测得酶活为11．17U／ml。     

土曲霉植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

参考已报道的植酸酶基因phyA全序列设计一对引物,用PCR方法从土曲霉穴Aspergillusterreus雪总DNA中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4kb的phyA基因编码区片段,对该片段进行了克隆与序列测定。进一步用该片段构建了pPIC9K-phyA分泌型表达载体,并转化毕赤酵母穴Pichiapastoris雪GS115。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳分析,植酸酶在重组转化子中得到了有效分泌和高效表达。摇瓶诱导发酵132h后发酵液中植酸酶的活性可达167u·mL-1;表达产物在pH2.0～8.0均有活性,最适pH为5.5,最适温度为55℃。     

耐有机溶剂脂肪酶基因lipI的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

为了实现耐有机溶剂脂肪酶基因的真核表达,参照GenBank公布的脂肪酶基因序列设计简并引物,通过PCR扩增出G.geotrichum SXL-107的全长1 692 bp、编码563个氨基酸的脂肪酶基因lipI,基因登录号为JX074060.利用Signal P 3.0软件对lipI基因序列进行分析,将去除自身信号肽的成熟lipI基因克隆到诱导型表达载体pPIC9K上,构建胞外重组表达载体pPIC9K-lipI,转化毕赤酵母KM71,发酵培养72 h,发酵上清液中脂肪酶活力达到70 U/mL,与野生型脂肪酶产生菌Galactomyces geotrichum SXL-107相比,脂肪酶活力提高7倍.获得的重组脂肪酶的最适温度40℃、pH值为6.5,在10％的甲醇溶液中作用48 h后仍然保持60％以上的酶活力.     

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

[目的]为豆豉纤溶酶的进一步研究与应用奠定基础。[方法]以从芽孢杆菌中提取的总DNA为模板,根据GenBank的豆豉纤溶酶基因(AY720895.2)DNA序列设计1对引物,克隆豆豉纤溶酶基因并进行序列测定。构建毕赤酵母表达载体pL3,在毕赤酵母中表达豆豉纤溶酶基因。[结果]经PCR扩增可获得约1.1 kb的DNA片段。序列分析表明所克隆DNA片段包含1个1089 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。该克隆基因与所发表的豆豉纤溶酶基因序列的核苷酸序列同源性为98%,而氨基酸序列同源性达100%。[结论]所克隆的豆豉溶纤酶基因在毕赤酵母中成功表达,且表达产物具有正常的生物学活性。     

微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达

以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列（No.X06219）存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。     

Pichia pastoris表达β-葡萄糖苷酶基因研究

采用Pichiapastoris(毕赤酵母)表达系统表达拟南芥β-葡萄糖苷酶基因(AT5g44640),获得了有活性的目的蛋白.研究了影响β-葡萄糖苷酶基因表达的因素.结果表明,表达载体整合拷贝数、不同P.pastoris菌株、甲醇体积分数、诱导培养时间和诱导培养起始的D(600nm)等对β-葡萄糖苷酶的产量都有一定的影响.     

密码子优化烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

[目的]烟曲霉(Aspergillus fumigatus)壳聚糖内切酶基因(Chitosanase,EC.3.2.1.132)(csn)的高效表达研究。[方法]根据毕赤酵母密码子的偏爱性对壳聚糖内切酶的基因进行了优化,利用连续延伸PCR方法扩增全长csn基因,构建重组质粒pPIC9k-csn,将重组质粒pPIC9k-csn线性化后转化毕赤酵母GS115,分析重组蛋白的表达,测定其酶活性,并对其酶解产物成分进行分析。[结果]实现了密码子优化后的壳聚糖内切酶的高效表达,重组菌株比野生菌株所产的壳聚糖内切酶活性提高了近20倍。[结论]该研究成功实现了烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,为工业化大规模生产壳聚糖酶奠定了基础。     

酸性植酸酶phyB在毕赤酵母GS115中的表达

通过PCR方法扩增得到无信号肽无内含子的酸性植酸酶phyB基因,将此基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并转化毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组毕赤酵母.在甲醇的诱导下,该植酸酶phyB基因在毕赤酵母中得到表达.经SDS-PAGE凝胶电泳分析,该重组蛋白的相对分子质量为7.5×104,而该植酸酶在大肠杆菌DH5α表达系统中表达的相对分子质量为6.0×104,这可能是由于糖基化的结果.酶学性质检测发现,表达的植酸酶最适作用温度为65℃,比野生原始菌株的提高了10℃;诱导pH值为5.5时,蛋白的表达量最高,为10 528.6 U/mL,是野生菌株的2.8倍;最适作用pH值为2.5;在70℃条件下处理60 min,该酶的相对酶活力为40%,在75℃时处理10 min,该酶的相对酶活力为10%.     

枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达

 【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69 kD,表达水平29.77 mg?L-1,水解酪素酶活力27 800 U?g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。