茄子花青素合成相关基因SmDFR的克隆与生物信息学分析

以茄子(Solanum melongena L.)"三月茄"为实验材料,参考NCBI上已公布的SmDFR基因,设计特异性全长引物,克隆SmDFR基因的gDNA全长序列。序列分析结果表明:该基因全长为1 482bp,包含5个外显子和4个内含子,编码区为1 149bp,编码382个氨基酸。蛋白序列相似性分析表明,SmDFR蛋白与马铃薯、辣椒、野生番茄和矮牵牛的DFR蛋白相似性分别为93%、93%、93%和90%。进化树分析表明,SmDFR与甜辣椒、马铃薯、西红柿聚为一类,亲缘关系比较近;与红薯、鱼黄草、田旋花亲缘关系最远。对于研究茄子花青素的生物合成及分子机制具有重要意义,也丰富了不同茄子品种SmDFR基因的相关研究。     

烟草肌醇半乳糖苷合成酶基因NtGolS1的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS,以辣椒GolS基因为探针,通过电子克隆法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码GolS基因的cDNA序列,暂被命名为NtGolS1.NtGolS1包含一个完整的开放读码框,编码343个氨基酸,具备糖基转移酶保守结构域;序列比对结果表明,NtGolS1蛋白与其他植物的GolS蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,NtGolS1与耐旱植物维柯萨的Gols亲缘关系最近.这些结果为进一步研究NtGolS1的性质和功能,并为植物抗逆基因工程研究提供理论基础     

烟草糖基转移酶基因NtGT3的克隆与生物信息学分析

为了给烟草糖基转移酶的生物学功能研究奠定基础,根据在GenBank上登录的烟草糖基转移酶基因NtGT3的CDS序列,以烟草栽培品种K326为材料,采用PCR的方法,对目的基因进行克隆,并测序。根据测序的结果,采用各类分析软件,对所获得的DNA片段进行生物信息学分析。结果通过PCR的方法,成功克隆了烟草糖基转移酶基因NtGT3的全长CDS序列。生物信息学分析结果表明,该基因CDS全长1 449 bp,所编码的蛋白质包含482个氨基酸。其分子量为54.15 ku,等电点为5.53。在二级结构上,α-螺旋和无规则卷曲为蛋白的主要结构形式。在三级结构上,具有42%的α-螺旋以及15%的β-折叠。NtGT3蛋白是一个亲水性蛋白质,含有2个糖基化位点,不含信号肽。NtGT3蛋白广泛分布于细胞中,在细胞膜、微体、高尔基体及内质网膜的分布分别达到了79%、31.9%、30%及20%。功能结构域分析结果证实,该蛋白包含有糖基转移酶家族的功能保守域PLN03015,属于GTB类型的糖基转移酶超级家族。同源性分析结果表明,NtGT3蛋白与枸杞、睡茄、甘薯、可可、猕猴桃、杨树、葡萄、野生大豆及拟南芥等的糖基转移酶有较高的序列相似性。NtGT3基因的成功克隆,为该基因功能的深入研究提供了理论支撑。     

海南普通野生稻STK类抗病基因 同源序列的分离与分析

根据植物STK 抗病基因的保守区域设计简并引物,以海南普通野生稻基因组DNA 为模板进行PCR 扩增,通过T/A 克隆、测序和序列分析, 共获得5 条具有连续ORF 的STK 抗病基因类似物（RGAs）序列,核苷酸序列间的相似性系数为37.82%耀99.25%,相应氨基酸序列间的相似性系数为31.28%耀98.86%。氨基酸序列结构分析表明,它们都具有STK 保守结构域,与已克隆的STK 类抗病基因有不同程度的相似性,为进一步克隆海南普通野生稻中的STK 类抗病基因提供依据。     

巴西橡胶树LIM结构域基因克隆与生物信息学分析

根据乙烯利刺激巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳差异表达cDNA文库的EST序列信息,利用RACE技术从胶乳中成功克隆了1个含有LIM结构域的未知功能新基因HbLIM的全长cDNA。生物信息学分析表明,该基因全长cDNA由1016bp的碱基组成,拥有1个570bp的开放阅读框编码189个氨基酸残基;推测氨基酸序列富含Lys,Ser,Ala和Leu,含有2个LIM结构域和2个N-豆蔻酰化位置。序列相似性分析表明,HbLIM编码的氨基酸序列与蓖麻、杨毛、葡萄相应的LIM基因的相似性高达98%,95%和92%。这些研究结果为深入探讨LIM结构域蛋白在巴西橡胶树乳管发育及乳管代谢中的功能奠定了基础。     

蓝莓角鲨烯环氧化酶基因的克隆与表达分析

角鲨烯环氧化酶(SQE)催化角鲨烯合成三萜类骨架β-香树酯前体2,3氧化鲨烯,是熊果酸合成途径中的重要限速酶。本研究采用RT-PCR技术从‘喜来’蓝莓根中克隆得到VcSQE基因,全长序列1 744 bp,序列分析结果表明,其含有1 620 bp开放阅读框,编码539个氨基酸;氨基酸同源序列分析表明,蓝莓与其它物种SQE蛋白氨基酸序列相似性很高,与山茶科的茶相似性最高,达90.6%,与猕猴桃相似性为89.7%;不同植物SQE蛋白序列分析发现,该类植物SQE含有3个保守结构域,均在VcSQE中存在;荧光定量试验表明,VcSQE基因在叶中表达量最高,根中表达量最低。     

玉米APRT基因的克隆及特征分析

腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT,adenine phosphoribosyltransferase)是催化腺嘌呤碱基转化为腺嘌呤核苷一磷酸(AMP)的关键酶。运用生物信息学,RT-PCR和RACE方法,从玉米叶片中克隆了1个1 202 bp的APRT基因cDNA片段,命名为ZmAPT2(GenBank登录号为AY485263)。该cDNA包含1个642 bp的开放阅读框,编码214个氨基酸。RPS-BLAST分析表明,玉米ZmAPT2蛋白有腺嘌呤磷酸核糖基转移酶的催化结构域。推导的玉米ZmAPT2氨基酸与水稻2型、小麦2型、拟南芥2型、大麦的APRT具有较高序列相似性,一致率分别为79%、75%、56%、56%。     

蓝莓鲨烯合酶基因的克隆与表达分析

鲨烯合酶基因(SQS)在植物三萜类化合物合成途径中起着重要作用,是上游代谢通路中的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从‘喜来’蓝莓根中克隆得到VcSQS基因,序列全长1 489 bp,序列分析结果表明,其含有1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸。氨基酸同源序列分析表明,蓝莓与其它物种SQS蛋白氨基酸序列相似性很高,与山茶科的茶相似性最高,达90.58%,与葡萄相似性达87.92%。荧光定量试验结果表明,SQS基因在蓝莓叶中的表达量最高,芽中的最低。     

梭梭糖基转移酶基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物糖基转移酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到2个同源的序列,分别命名为HaUGT1和HaUGT2。基因测序结果显示,HaUGT1基因编码区长1 485bp,编码495个氨基酸;HaUGT2基因编码区长1 185bp,编码394个氨基酸。HaUGT1和HaUGT2蛋白具有保守的PSPG基序、UDP-葡萄糖基转移酶结构域,与其他植物中的糖基转移酶蛋白同源性较高。     

割手密谷胱甘肽硫转移酶基因SsGST 的克隆与生物信息学分析

为克隆割手密谷胱甘肽硫转移酶基因,采用电子克隆和RT-PCR技术获得了1个割手密GST基因,命名为Ss GST,并对其进行生物信息学分析。序列分析表明,割手密Ss GST基因c DNA全长702 bp,编码224个氨基酸,蛋白分子式为C1119H1756N300O327S5,预测蛋白质分子量为24.8 ku,等电点为6.21。蛋白疏水性分析表明Ss GST蛋白为亲水性蛋白。保守结构域预测表明Ss GST蛋白具有GST-N和GST-C结构域。Ss GST蛋白序列与玉米、高粱、谷子和甘蔗等植物的GST蛋白序列相似性较高,系统进化树分析表明,Ss GST蛋白与玉米GST蛋白亲缘关系最近。     

雨生红球藻植物类型隐花色素基因克隆与序列分析

为了从雨生红球藻中获得感知蓝光信号的植物类型隐花色素(CRY)序列,采用同源克隆和RACE相结合的方法获得了雨生红球藻编码植物类型Hae-P-CRY的c DNA全长,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明,Hae-P-CRY基因的c DNA全长为3 608 bp,包含开放阅读框全长2 988 bp,编码995个氨基酸,预测等电点6.19,理论分子质量为107.7 ku。经Blast P分析发现,Hae-P-CRY氨基酸序列与莱茵衣藻来源植物类型Cre CRY氨基酸序列的相似性达到66.6%,与拟南芥CRY氨基酸序列相似性为46.94%。系统进化分析表明,Hae-P-CRY与其他真核绿藻来源的植物型CRY聚在一支,属于植物类型CRY。结构域分析表明,Hae-P-CRY基因含有光感知PHR结构域和信号转导CCT结构域,暗示具有感知和转导光信号功能。试验从雨生红球藻得到植物类型Hae-P-CRY基因序列,可为其表达、功能及互作蛋白研究奠定基础,同时为进一步解析雨生红球藻在蓝光响应中的分子机制奠定基础。     

哈茨木霉几丁质合酶基因ThChsC的克隆及序列分析

 【目的】克隆哈茨木霉几丁质合酶基因全序列,并对序列进行生物信息学分析。【方法】利用多聚酶链式反应（PCR）和染色体步移技术（genome walking）克隆几丁质合酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,对蛋白质的三维结构进行预测。【结果】从哈茨木霉（Trichoderma harzianum Th-33）中扩增得到几丁质合酶基因ThChsC（GenBank登录号HQ419000）,编码区（CDS）长为2 835 bp,由4个外显子和3个内含子组成,开放阅读框（ORF）长2 688 bp,编码895个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该基因与串珠状赤霉（Gibberella moniliformis,ACY08039.1）和禾生刺盘孢菌（Colletotrichum graminicola,AAL23718.1）几丁质合酶基因相似性最高,分别为80%和81%;相应的氨基酸序列同源性均为80%,系统进化分析表明,ThChsC属于III型几丁质合酶亚家族。几丁质合酶ThChsC含有1个Chitin_synth_1结构域,1个Chitin_synth_1N结构域,1个Chitin_synth_2结构域,3个跨膜结构域,不含信号肽,为膜结合蛋白。对预测的三维结构分析表明,ThChsC含有糖基转移酶的保守DHD结构域。【结论】从哈茨木霉Th-33中克隆得到几丁质合酶基因ThChsC,对该基因的深入研究有助于探索哈茨木霉几丁质合成的机制。     

普通野生稻(Oryza rufupogon)糖基转移酶基因OrGT1(t)的克隆与表达分析

【目的】对野生稻中木糖基转移酶基因开展初步研究,为进一步探索单子叶植物中木葡聚糖的合成及功能研究打下坚实的基础。【方法】利用同源克隆的方法,从普通野生稻(Oryza rufipogon)中克隆了1个糖基转移酶基因OrGT1。【结果】序列分析结果显示:该基因具有1个保守的Glyco-transf-34结构域,属于糖基转移酶34家族的基因。系统进化分析表明:该基因可能是1个木葡聚糖合成中的木糖转移酶基因。实时荧光定量分析表明:该基因在普通野生稻的在根、茎、叶和穗中均有表达,但在不同组织中表达有明显差异,其中茎的表达量最高,而根中的表达量最低。【结论】OrGT1基因在进化过程中高度的功能保守性,推测OrGT1(t)基因可能是1个参与木葡聚糖合成的木糖基转移酶基因,该研究结果为进一步探索该基因的功能打下良好的基础。     

森林草莓转录因子MYB 12基因克隆及蛋白特性分析

采集森林草莓(Fragaria vesca)植株叶片,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物RT-PCR扩增转录因子MYB 12基因,获得1条约1 kb大小的特异性片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段序列全长988 nts,含有完整的MYB 12基因开放阅读框(ORF),ORF长度为855 nts,编码285个氨基酸。序列比对发现,森林草莓MYB 12基因与来源于5种蔷薇科植物MYB基因的序列相似性较高,为75%~76%,而与其他7种非蔷薇科植物MYB基因的序列相似性相对较低,为47%~68%。构建MYB基因系统关系树,发现森林草莓与其他5种蔷薇科植物的MYB基因聚成一个分支,说明森林草莓与蔷薇科植物亲缘关系较近。生物信息学分析表明,MYB 12蛋白具有一定的亲水性,其N-端有2个MYB结构域,属于R2R3-MYB亚族。MYB 12蛋白二级结构主要以α-螺旋为主,并含有一些不规则的卷曲(Random coil)结构。这为研究该基因在植物生长发育及生理代谢过程中的调控机制奠定了基础。     

节瓜抗镰刀菌酸突变体NBS类RGAs序列的分离鉴定

为挖掘和利用节瓜抗病种质资源,根据已克隆植物NBS-LRR(nucleotide binding site and leucine rich repeat)类抗病基因保守区设计简并引物,从节瓜抗镰刀菌酸突变体"LT3"的基因组DNA中扩增得到250 bp目的条带,通过重组克隆及测序获得22条NBS抗病同源序列(命名为JNB1~JNB22)。利用DNAStar软件及NCBI Blastx同源搜索发现,这些抗病同源序列长度为249~250 nt,推导氨基酸序列具有P-loop、Kinase-2a典型NBS类R基因保守结构域,其中21条具连续ORF(open reading frame);核苷酸序列相似性在48.8%~99.2%,氨基酸序列相似性为18.1%~100.0%;氨基酸序列聚类分析分为6个组。Blast结果显示,节瓜RGAs(resistance gene analogs)核苷酸序列与其他植物R基因最高相似性为72%~99%,对应氨基酸序列与其他植物具有36%~100%相似性,多数序列与冬瓜R基因相似性最高;同源进化分析表明,所有节瓜RGAs序列均为non TIR-NBS-LRR类,与氨基酸序列同源比对结果一致。节瓜NBS类抗病同源序列的分离鉴定为进一步克隆功能性抗病基因及分子标记辅助抗病育种提供参考。     

‘红阳’猕猴桃MYB基因的克隆与表达

为探讨MYB基因在‘红阳’(Actinidia chinesis‘Hongyang’)猕猴桃果实着色过程中的重要作用,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了‘红阳’猕猴桃的一个MYB转录因子基因。该基因的cDNA全长962bp,序列包含一个666bp的开放阅读框(ORF),编码221个氨基酸残基的蛋白质,其N端具有2个典型的MYBDNA结合域。同源性分析显示,该酶的氨基酸序列与矮牵牛、葡萄、番茄、金鱼草等植物中花青素途径相关的MYB转录因子基因的相似性都达到80%以上。实时荧光定量PCR分析结果显示,AcMYB在‘红阳’猕猴桃中的表达量与花青素含量呈正相关,二者均在果实转色主要阶段维持较高水平,推测该基因在调控花青素合成的过程中起着重要作用。     

基于转录组测序的紫色秋葵花青素合成相关基因研究

紫色秋葵富含花青素,因此其全株及果实均为紫红色,为获取正常生长状态下紫色秋葵花青素合成代谢相关基因,采用Illumina HiSeq 2500高通量转录组测序技术对紫色秋葵全转录功能基因组测序后组装,再通过Nr、SwissProt和GO等三大数据库进行花青素相关功能基因筛选。三大数据库涉及35个花青素相关Unigene,具体包括19个花青素相关糖基转移酶、6个花青素酰基转移酶家族基因,5个无色花色素双加氧酶(合酶)以及5个花色素相关还原酶。这些花青素相关基因在Nr及SwissProt数据库中涉及较多相关植物,包括拟南芥、可可、树棉、木薯、苹果及葡萄等。聚类分析研究表明:涉及花青素相关四大家族成员的35个Unigene中,无色花色素双加氧酶亲缘关系最近,花青素酰基转移酶次之,花青素相关还原酶亲缘关系稍远,而花青素相关糖基转移酶家族成员亲缘关系最远。本研究获取的紫色秋葵众多花青素相关转移酶、合酶及还原酶等相关Unigene,为进一步研究紫色秋葵或其他植物的花青素合成代谢过程中基因克隆分析等奠定了坚实基础。     

蓝莓FLC基因电子克隆及生物信息学分析

FLC基因是MADS-box家族的重要成员,参与调控植物花芽分化和开花过程,在春化作用中起关键作用。以拟南芥(Arabidopsis thaliana)FLC基因编码蛋白序列(Gen Bank登录号:AAN04056.1)为探针,运用电子克隆方法获得蓝莓(Vaccinium spp.)FLC基因(VaFLC)c DNA序列,对其编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、保守序列、二级结构和三级结构特点进行预测分析,并对该编码蛋白与其他植物中FLC基因编码蛋白的相似性和进化关系进行研究。结果表明,蓝莓FLC基因c DNA全长1 303 bp,包含1个长度为753 bp的完整开放阅读框,编码250个氨基酸,编码蛋白含有MEF2-like MADS域、I域、K域和C域4个明显的结构域,属于MADS-box基因家族中植物Ⅱ型(MIKC型)基因。在蓝莓FLC基因编码VaFLC蛋白与其他植物FLC蛋白的相似性方面,除与大豆的相似性为38%之外,与其他植物的相似性均高于40%,其中与葡萄、柑橘具有47%的相似性,与拟南芥、可可树、白桦具有46%的相似性,与梨树具有45%的相似性。蓝莓VaFLC蛋白在系统进化树上归为木本植物分支,并形成独立的小分支,推测该基因及其编码蛋白在植物FLC进化过程中保留了部分原始特征。     

杜仲糖基转移酶基因EuCGT1克隆及序列分析

本研究以杜仲(Eucommia ulmoides)7月雌株新生幼枝的树皮为材料,根据杜仲转录组测序数据中筛选的一个糖基转移酶基因(CGT)片段信息设计引物,采用SMART RACE技术,克隆了5’-端1432bp和3’-端535 bp cDNA片段,测序拼接后获得全长1 583 bp的杜仲CGT的cDNA序列。分析结果表明,该cDNA开放阅读框长1 464 bp,编码487个氨基酸,命名为EuGT基因。EuGT在NCBI中经blastn比对,显示序列与甜橙和草莓的UDP-葡萄糖基转移酶基因同源性分别为72%和67%;推测的氨基酸序列经blastp和CDD比对,显示序列与UDP-葡萄糖类黄酮3-O-糖基转移酶-6同源,其中含有UDP-葡萄糖基转移酶的保守域(pfam00201),初步推测EuCGT1蛋白属于糖基转移酶家族。本研究克隆的EuGT基因是首次从杜仲中克隆的糖基转移酶家族基因。以EuCGT1基因构建的植物表达载体pSH-35S-EuCGT1采用农杆菌介导法遗传转化烟草,获得了含EuCGT1基因的转基因烟株,移栽生长1个月的转基因烟草植株在表型上与野生型烟草无明显差异。     

甘蓝SRK底物蛋白基因的克隆与序列分析

采用PCR、3’RACE以及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对SSP基因进行扩增克隆,得到长度分别为778 bp和825 bp的基因片段。序列分析表明,甘蓝SSP基因不包含内含子,SSP核苷酸序列与拟南芥肽酶M28家族蛋白有同源性,序列相似性达到67.4%,两者的氨基酸序列相似性达到62.7%,而且都含有一个TFR_dimer结构域,推测SSP蛋白极有可能与在自交不亲和过程中受ARC1作用而泛素化了的某一未知蛋白的降解相关。