CgRGS7调控胶孢炭疽菌分生孢子产量、附着胞形成及致病性

【目的】G蛋白信号调控因子(regulators of G-protein signaling,RGS)是G蛋白信号转导通路中的负调控因子,参与多个G蛋白信号通路介导的细胞内过程,目前对于胶孢炭疽菌相关RGS蛋白的生物学功能研究较少。【方法】本研究通过同源重组获得CgRGS7基因的敲除突变体,并对其生物学功能进行初步分析。【结果】CgRGS7基因编码620个氨基酸,具有7个跨膜结构域和1个RGS功能域。CgRGS7敲除突变体与野生型菌株相比,表现为分生孢子产量降低且孢子呈多端萌发,附着胞形成率下降以及致病性减弱。【结论】CgRGS7参与调控胶孢炭疽菌分生孢子产量,同时影响芽管的形态发育、附着胞形成及致病性。     

CgCDA3基因缺失对胶孢炭疽菌生长和侵染致病的影响

为了明确CgCDA3基因在胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)生长及侵染致病过程中的功能,从C. gloeosporioides基因组中克隆CgCDA3基因,首先进行生物信息学分析,然后利用基因同源重组的方法获得CgCDA3基因缺失突变体(△cda3),最后分析了△cda3的孢子萌发、附着胞形成和侵染致病性变化。结果表明,CgCDA3基因ORF全长1 470 bp,编码含489个氨基酸的蛋白质,其含有一个聚多糖去乙酰化酶保守结构域。CgCDA3蛋白与已知的西瓜炭疽菌(C. orbiculare)、禾生炭疽菌(C. graminicda)和睡莲炭疽菌(C. nymphaeae)的CDA蛋白同源性较高,同源性分别为63%、60%和80%。CgCDA3基因缺失突变体同野生型相比,生长及产孢正常,但表现为孢子萌发能力下降,附着胞形成率降低,同时侵染芒果的致病性也显著减弱。推测CgCDA3基因参与调控胶孢炭疽菌孢子萌发和附着胞形成等形态生长和建成过程,从而对其致病性产生一定的影响。     

轮枝镰孢菌FvST12基因敲除载体的构建及功能分析

[目的]鉴定并分析轮枝镰孢菌中 STE12 类转录因子的基因功能.[方法]以尖孢镰孢菌转录因子Fost12蛋白为靶序列,在轮枝镰孢菌基因组数据库中进行BlastP搜索,发现一个与Fost12蛋白同源性高达98%的基因,命名为FvST12.基于Double-Joint PCR技术,构建该基因的敲除载体,通过真菌原生质体转化及筛选获得基因敲除突变体,并对突变体的表型及致病性进行系统分析,以明确该基因的功能.[结果l突变体在生长速率、菌落形态,产孢量以及高渗和氧化等逆境胁迫反应上与野生型无显著差异;致病性分析表明,突变体致病力明显下降.[结论]轮枝镰孢菌FvST12对致病性起重要调控作用,但不参与营养生长、产孢和高渗和氧化胁迫等逆境反应.     

禾谷镰孢核孔蛋白基因FgNup42的功能分析

【目的】核孔蛋白Nup42在真核生物基因表达调控以及mRNA加工运输等生物学过程中发挥着重要作用,本研究旨在分析禾谷镰孢(Fusarium graminearum)中核孔蛋白基因FgNup42在病原菌生长发育、逆境胁迫、致病和产毒等生物学过程中的功能。【方法】通过融合PCR(double-joint PCR)和酵母空隙修复(gap repair)技术分别构建FgNup42基因敲除和回补载体,再利用PEG介导的原生质体转化的方法获得基因敲除突变体ΔFgNup42和回补体ΔFgNup42-C。观察测定基因敲除突变体ΔFgNup42在营养生长、无性繁殖和有性生殖过程中的变化,同时测定突变体ΔFgNup42对渗透、杀菌剂以及细胞壁胁迫因子的敏感性。将突变体ΔFgNup42进行田间麦穗和室内玉米花丝接种试验明确其致病力情况。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测ΔFgNup42的产毒能力,同时利用qRT-PCR比较分析参与单端孢霉烯族毒素生物合成的7个TRI在野生型PH-1和基因敲除突变体ΔFgNup42中的相对表达量。【结果】表型测定发现,基因敲除突变体ΔFgNup42的生长速率只有野...     

一个假定的稻瘟病菌RhoGEF蛋白参与营养生长和产孢过程的调控

对稻瘟病菌致病机制的认识将有助于更好地防治水稻稻瘟病.在明确多个Rho族小G蛋白在该菌营养生长、分化孢子形成以及侵染致病过程中起到重要作用的基础上,进一步研究Rho族小G蛋白调控因子-鸟苷酸交换因子(GEF)的功能.以生物信息学和分子遗传学方法,研究了稻瘟病菌基因位点Mgg_11178.6所编码蛋白的功能.结果表明Mgg_11178.6编码一个假定的Rho族小G蛋白鸟苷酸交换因子(MoRGF1),与多种丝状子囊菌RhoGEF亲缘关系密切;基因敲除突变体表现为生长速度减慢,产孢量明显减少,但是致病力没有变化.说明该假定的Rho族小G蛋白鸟苷酸交换因子(MoRGF1)可能参与稻瘟病菌营养生长与产孢过程的调控.     

植物病原丝状真菌RGS的研究进展

G蛋白信号调控因子(RGS)作为G蛋白信号途径中发挥重要的负调控作用的蛋白,其功能主要表现影响真菌菌丝生长、产孢等发育阶段,以及次生代谢产物、色素合成等致病性方面.近些年,随着学术界对于植物病原丝状真菌RGS蛋白研究的不断深入,产生了大量的学术报道,然而,尚缺乏对模式真菌与植物病原丝状真菌中RGS蛋白系统性对比分析的研...     

橡胶树胶孢炭疽病菌CgBASP2基因敲除突变体构建及其致病力分析

在前期对橡胶树胶胞炭疽病菌分泌蛋白组进行预测的基础上,通过RT-PCR的方法克隆了1个候选分泌蛋白基因并命名为Cg BASP2(Biotrophy-associated Secreted Proteins 2 of Colletotrichum gloeosporioides)。该基因编码100个氨基酸,相对分子质量约为9.85×103。生物信息学分析结果表明,该蛋白含有1个18氨基酸的信号肽序列,不含任何跨膜结构域。氨基酸序列比对结果表明,Cg BASP2与草莓胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5)、西瓜炭疽菌(Colletotrichum orbiculare MAFF)、玉米炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、菜豆炭疽菌(Colletotrichum higginsiaum)和稻瘟菌(Magnaporthe oryzae 70-15)的BASP2同源,同源性分别为100%,90%,87%,87%和67%。为了研究该基因的功能,本研究通过同源重组技术构建了橡胶树胶孢炭疽病菌Cg BASP2基因的敲除突变株ΔCg BASP2。进一步的分析发现,与野生型菌株相比ΔCg BASP2突变菌株不能对橡胶树叶片产生致病性,由此可见,Cg BASP2基因在胶胞炭疽病菌的致病过程中起重要作用。     

草莓胶孢炭疽菌GPCRs超家族蛋白鉴定及生物信息学分析

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是广泛存在于生物体中的一类膜受体家族。基于粗糙脉孢菌典型GPCR蛋白氨基酸序列及其典型结构域对胶孢炭疽菌全基因组数据库进行比对分析,获得GPCRs超家族蛋白;对GPCRs超家族蛋白进行生物信息学分析。结果表明:胶孢炭疽菌中存在8个GPCR蛋白,其中碳源感应因子类有3个;类cAMP受体类有2个,信息素受体、氮源感应因子和真菌视蛋白类各1个。所有的GPCR都具有典型的7个跨膜结构域及较高比例的α-螺旋和无规则卷曲,且均不含信号肽序列。通过遗传关系比较分析发现,胶孢炭疽菌的8个GPCR蛋白聚类在一起,构成2个主要进化大分支和5个小分支,该聚类与其基于保守结构域的归属类别一致。本研究为进一步探究草莓胶孢炭疽菌GPCRs超家族成员的功能奠定了基础。     

转录因子MoOaf22对稻瘟病菌营养生长、细胞壁完整性和胁迫应答的调控

为了研究油酸激活型转录因子MoOaf22编码基因MoOAF22(MGG_03413)在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的功能,利用基因敲除方法将其进行了缺失突变并对突变体进行了一系列的生物学表型分析。结果表明该基因缺失突变体在完全培养基(CM)上营养生长加快,但在基本培养基(MM)上生长变慢,同时该突变体原生质体释放速度变慢,对荧光增白剂(CFW)和刚果红(Congo Red)耐受性增强,对十二烷基磺酸钠(SDS)、氯化钠(Na Cl)和山梨醇(Sorbitol)敏感,但该突变体在产孢量、附着胞形成及致病性等方面较野生型没有明显变化。说明MoOaf22在稻瘟病菌的营养生长、细胞壁完整性和对外界的胁迫应答过程中具有重要的调控作用。     

禾谷炭疽菌CgRAB4的功能研究

[目的]阐明禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola)中CgRAB4的功能,为探究Rab蛋白在禾谷炭疽病菌中的保守性和特殊功能奠定理论基础.[方法]通过同源重组的方法对CgRAB4进行基因敲除,经潮霉素抗性筛选和PCR验证后获得缺失突变体,进而分析其在禾谷炭疽菌生长发育和侵染致病过程中的作用.[...     

禾谷镰孢碳源代谢调控因子FgCreA的功能

【目的】敲除禾谷镰孢（Fusarium graminearum）中碳源代谢调控因子FgCreA,并对其营养生长、有性生殖和致病力等方面进行研究,为研究禾谷镰孢中碳源代谢机制提供依据。【方法】根据酵母数据库SGD和NCBI数据库中的序列,利用酿酒酵母中碳源代谢调控因子Mig1确定禾谷镰孢中的碳源调控因子FgCreA;在NCBI数据库中检索其他物种中碳源代谢调控蛋白,使用ClustalW2软件进行多重序列比对,并用MEGA5软件构建系统进化树,同时在InterProScan网站上预测其蛋白结构域;在NCBI数据库中检索与禾谷镰孢碳源吸收相关的结构基因和真菌毒素DON生物合成的相关基因,调取起始密码子上游1 000 bp的片段,预测FgCREA基因结合位点位置;用Primer5软件设计引物,利用Split-PCR和PEG介导原生质体转化的方法进行基因敲除,并通过PCR和Southern blot验证获得FgCREA基因敲除突变体Fgcrea。根据突变体Fgcrea营养生长、有性生殖和致病力等方面的变化分析FgCREA的功能。【结果】通过生物信息学方法,明确禾谷镰孢中只有一个碳源代谢调控因子基因FgCREA(FGSG_09715),氨基酸序列416 aa,共包含两个保守的C2H2锌指结构区域。FgCreA同源蛋白在各类真菌中均存在一定程度的同源性,具有较高的保守性。禾谷镰孢碳源吸收相关结构基因（XYL2、ARA1、ICL1、PG1、SUC2）和真菌毒素DON生物合成相关基因（TRI1、TRI3、TRI4、TRI5、TRI6、TRI7、TRI8、TRI10、TRI12、TRI101）启动子区均含有FgCREA DNA结合位点。采用Split-PCR技术和PEG介导的原生质体转化,通过PCR和Southern blot获得并验证了两个FgCREA基因敲除突变体。表型观察发现,突变体Fgcrea的生长速度与野生型相比下降90%;分生孢子形态正常,但产孢量与野生型相比降低88%;有性生殖阶段,突变体Fgcrea可以产生正常的子囊壳、子囊和子囊孢子,但需要比野生型长20-28 d;突变体Fgcrea对钠盐较敏感,侵染小麦穗不发病。【结论】获得禾谷镰孢碳代谢调控因子FgCreA敲除突变体,明确FgCreA参与营养生长和有性生殖,并能够影响致病过程。但是否影响相关结构基因的转录水平和DON生物合成仍需进一步验证。     

香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种mon1基因敲除转化子的表型分析及致病力测定

根据笔者实验室前期蛋白质组学研究成果,发现尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)中的mon1基因影响了尖孢镰刀菌的致病性,为了研究mon1基因在Foc4侵染香蕉过程中的具体作用,利用同源重组方法敲除了Foc4的mon1基因,并对获得的敲除突变体开展表型分析和致病性测定。结果表明,与Foc4野生型菌株相比,敲除突变体生长缓慢、菌丝变细,分支减少及产孢量降低,菌株抵抗外源氧胁迫、细胞壁穿透能力、纤维素利用能力减弱,对巴西蕉苗的致病力明显减弱。由此推测mon1基因在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有一定的作用。     

MoFbc1调控稻瘟病菌生长与致病机制初探

真核生物体内,F-box蛋白作为泛素连接酶复合物(Skp1-Cullin1-F-box,SCF)的调节亚基,参与降解底物的特异性识别。为探究F-box家族基因MoFbc1在稻瘟病菌生长发育及侵染致病中的功能,采用生物信息学方法分析Mo Fbc1蛋白结构域并构建进化树。利用同源重组方法获得MoFbc1基因敲除及其回补菌株并进行表型分析。结果表明,MoFbc1敲除菌株在产孢、附着胞形成及致病性等方面与野生型菌株均无显著差异。但其在MM和RDC培养基上生长速率下降,表明MoFbc1基因可能参与调控稻瘟病菌对部分营养物质的利用;突变体对细胞壁胁迫因子CFW、CR敏感,提示其细胞壁结构可能发生改变。结果为进一步揭示基因MoFbc1调控稻瘟病菌生长发育机制奠定基础。     

香蕉枯萎病4号小种T-DNA 插入突变体 Focr4-1453表型特征及致病性分析

尖孢镰刀菌古巴转化型是引起香蕉枯萎病的主要病原菌,呈世界多态性分布,其致病机理尚不清楚。 Focr4-1453 为T-DNA 插入突变体库中筛选出的一株与致病性相关的突变体。在克隆出其失活基因之后,将“生型 菌株中的相同基因进行敲除和互补,得到敲除突变体驻Foc4-1453 和互补突变体驻Foc4-1453-cp-1。对获得的3 株 突变体进行生物学表型研究发现,这些菌株的菌落生长速度、产孢能力以及孢子萌发率较“生型菌株明显降低,且 无法透过玻璃纸进行生长。致病性测定试验表明,该基因失活会导致病原菌侵染能力显著减弱。     

芒果VOZ转录因子基因家族成员鉴定及生物信息学分析

【目的】对芒果维管束锌指蛋白（VOZ）基因家族成员进行鉴定并对其生物信息学进行分析,为深入探究芒果VOZ转录因子在免疫反应中的生物学功能提供理论参考。【方法】基于芒果全基因组数据,利用生物信息学方法鉴定芒果VOZ转录因子基因家族成员,并分析其理化性质、保守基序及系统发育进化。通过实时荧光定量PCR检测胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）与细菌性黑斑病菌（Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae）侵染下的相对表达量。【结果】从芒果全基因组中间鉴定出4个VOZ转录因子家族成员,分别为MiVOZ1、MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4基因,开放阅读框（ORF）长度为1290~1482 bp,编码氨基酸数量为429~493,蛋白分子量为47.26~54.96 kD,等电点（pI）为5.47~6.00,亲/疏水性指数为-0.663~-0.552,不稳定指数为37.66~50.86,二级结构均以无规则卷曲和α-螺旋为主要元件。芒果和其他9个物种的49个VOZ蛋白聚为十个分支,在ClassⅠ中3个MiVOZs蛋白（MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4）与苹果、木薯和毛果杨聚类在一起,在ClassⅤ中MiVOZ1与拟南芥、木薯和毛果杨聚类在一起。在胶孢炭疽菌侵染下,仅MiVOZ1和MiVOZ2基因的相对表达量较对照显著升高（P<0.05,下同）;在细菌性黑斑病菌侵染下,仅MiVOZ2基因的相对表达量较对照显著升高。【结论】芒果VOZ转录因子在抵御不同病原菌侵染的生物学功能方面存在差异,其中MiVOZ2基因在抵御胶孢炭疽病和细菌性黑斑病侵染的免疫反应中具有相似生物学功能,属于正调节因子。     

稻瘟病菌假定核糖体生成因子MoRei1功能研究

为深入探究稻瘟病菌假定核糖体生成因子MoRei1的生物学功能,通过敲除MoREI1基因、分析ΔMorei1突变体表型、鉴定基因互补及其互作蛋白功能等对其进行了研究。结果表明：敲除MoREI1基因后,稻瘟病菌ΔMorei1突变体的有性生殖能力丧失,附着胞形成率显著下降,致病力减弱;ΔMorei1突变体对细胞壁和氧化胁迫因子的敏感性增强,附着胞发育过程中糖原的移动和降解速率下降。稻瘟病菌MoREI1基因可恢复酿酒酵母REI1基因缺失突变体的部分表型,说明MoRei1与酵母核糖体生成因子Rei1在功能上具有同源性,并可能在核糖体生成过程中起类似的作用。稻瘟病菌MoRei1蛋白与预测的核输出因子MoAlb1间存在物理互作,且MoREI1基因缺失可影响稻瘟病菌MoAlb1蛋白的亚细胞定位。上述研究结果对阐明MoRei1在稻瘟病菌形态分化和致病性中的作用及其机制有重要意义。     

Rho型GTPase激活蛋白MoBem2在稻瘟病菌分生孢子形态建成中的功能

为了研究Rho型GTPase激活蛋白编码基因MoBEM2(MGG_09303)在稻瘟病菌致病过程中的作用,利用基因敲除方法进行了缺失突变。结果显示该基因缺失突变体产孢量显著下降40%左右,利用荧光增白剂(CFW)染色发现孢子形状变得畸形,形成单个隔膜孢子,约为40%左右,而野生型超过90%均为正常孢子;另外,该基因的缺失导致突变体在培养8 h时附着胞形成率显著下降,随着时间的延长,突变体附着胞形成率逐渐上升到野生型程度。可见,Mo Bem2蛋白调控稻瘟病菌分生孢子的形态建成,延缓分生孢子萌发过程中附着胞的形成,但对稻瘟病菌的致病性没有影响。     

美丽异木棉茎腐病病原菌分离与鉴定

从苗圃地采集美丽异木棉茎腐病样本,进行组织分离培养,致病性测定,采用形态学结合多基因(核糖体内转录间隔区、β-微管蛋白、几丁质合成酶、肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶)分子系统学的方法,对分离菌株进行鉴定,发现分离获得的炭疽菌与其他所有胶孢炭疽菌聚在一起,形成一个明显的分支,确定病原菌为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz。     

小麦赤霉菌FGSG_03700基因敲除及功能研究

[目的]敲除小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)FGSG_03700基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。[方法]应用Split Marker基因敲除技术,构建含有潮霉素抗性基因hph的基因敲除盒,通过PEG介导,进行原生质体转化,在含有潮霉素的培养基上筛选转化子。[结果]通过PCR正负筛查,得到3个确定的突变体,分别命名为ΔFGSG_03700 1-2、ΔFGSG_03700 2-2、ΔFGSG_03700 2-3。通过表型验证及孢子对番茄侵染试验发现,敲除突变体的菌落形态及生长速度没有明显变化,致病力没有减弱,但突变体的产孢量低于野生型PH-1。[结论]FGSG_03700基因可能与小麦赤霉菌分生孢子的生长能力有关。     

胶孢炭疽菌漆酶基因Lac2的序列特征与表达分析

为了探明分离自芒果的胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)漆酶同工酶基因的序列特征,进一步研究该菌的分子致病机理。以该菌为材料,采用同源克隆和RT-PCR法获得胶孢炭疽菌漆酶基因Lac2(KF924625)。结果表明,其编码区大小为1 785 bp,编码594个氨基酸,分子量为65.53 ku,等电点是6.56,含4个铜离子结合保守结构域;聚类分析发现,其预测蛋白与西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的漆酶laccase-1(ENH77191.1)同源性最高,达到79%;半定量RT-PCR分析表明,在分生孢子不同萌发时段,Lac2的表达量有明显的升降趋势,接种后6 h表达量最低,9 h最高。可见Lac2具备真菌漆酶基因家族的序列特征,初步推测它可能与C.gloeosporioides分生孢子萌发侵染寄主有关,也可能参与调控芒果胶孢炭疽菌的漆酶活性和抗氧化反应等。