冰核活性细菌研究进展及其在防霜技术中的应用

冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因子,通过减少和控制冰核细菌,在霜冻防治研究方面取得了一定效果．细菌冰核是一类蛋白质,称冰蛋白,由细菌冰核基因编码,据报道已有11种冰核细菌的冰核基因被克隆并在大肠杆菌中得到表达．综述了冰核细菌生物学及分子生物学特性,以及冰核细菌在防霜技术中的应用,阐述了冰核细菌的种类、影响冰核活性的成冰因素及冰核细菌和霜冻害的关系．药剂和生防菌能够防除植物上的冰核细菌．减轻或控制霜冻危害,是防御植物霜冻的一条新途径．     

冰核活性细菌拮抗菌株的筛选

 从多种植物根际土壤中分离到300个细菌分离物,通过含菌平板培养筛选出F015,F023,F046等近20株对冰核细菌具有较强的拮抗力,室内测定对冰核细菌病原物抑菌圈达0.8～3.0 cm. 挑选出F015,F023,F046进一步进行室内抗菌机理、菌株鉴定和室外田间小区实验。实验结果表明,菌株初步鉴定为芽孢杆菌（Bacillus spp.）和假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）。其代谢产物蛋白质粗提物对冰核细菌的生长有明显的抑制作用。室外防霜效果在19.5％～36.9％,可有效地控制霜冻害的发生与危害,具有广阔的应用前景。     

利用转座子Tn5诱变冰核细菌获得无冰核活性菌株

 以云南省冰核细菌的优势种类丁香假单胞菌Pseudomonas syringae和菠萝泛菌Pantoea ananas为重组基因工程菌的受体菌,采用Tn5转座子诱变技术,以大肠杆菌Escherichia coli S17／pZJ25∶∶Tn5作为转座子诱变的供体菌,使Tn5插入并整合到冰核细菌基因组中,使冰核基因的线性连续性被破坏,失去冰核活性。大量筛选接合子,获得157株丧失冰核活性的菌株。     

杨树冰核细菌溃疡病发病的主导因素

在我国东北地区、杨树上普遍存在的冰核活性（INA）细菌，能在温度-4℃以下产生冰核活性，主要种类为：成团泛氏菌[Pantoea agglomeransGavinietal=Erwinia herbicola]、菠萝泛氏菌[Pantoea ananas(Serrano)Mergaert et al=E.ananas]、大黄欧文氏菌[Erwinia rhapontici(Millard)Burkholder]、噬夏孢欧文氏菌[Erwinia uredovara(Pon.et al)Dye]和丁香假单胞菌[Pseudomonas syringae pv.syringue Van Hall]。它们主要分布于感病寄主的冻枝、冻死芽、枝干肿包、溃疡瘤、病枝、真菌溃疡病斑等部位，春秋两季为活动期和侵染期，出现频率最高，占细菌分离数的50%以上，泛氏菌占优势，在病部内外均有分布，内部较多，杨树冰核活性细菌在春秋季节霜冻条件下能造成杨树冻达，并引起肿茎型细菌溃疡病，是病害发生的主导因素，研究还证明，杨树冰核活性细菌能增强真菌溃疡病菌的侵染，促进真菌溃疡病的发生。     

冰核细菌的研究、应用现状和前景

冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因子,通过减少和控制冰核细菌,在进行霜冻防治研究方面,取得了一定效果.目前世界上已发现4个属23个种或变种的细菌具有成冰活性.细菌冰核是一类蛋白质,称冰蛋白,由细菌冰核基因编码,报道已有11种冰核细菌的冰核基因被克隆并在大肠杆菌中得到表达.综述了冰核细菌生物学及分子生物学特性,以及冰核细菌在霜冻防除、人工降雨、食品冷藏保鲜、高敏检测和促冻杀虫等方面的研究进展和应用前景.     

诱发枇杷霜冻害的冰核细菌拮抗菌分离与筛选

[目的]筛选出具有防除枇杷INA细菌的拮抗菌.[方法]从枇杷根际土壤中分离冰核细菌拮抗菌,对其进行抑菌圈、杀菌能力、破坏冰核活性蛋白能力测定.[结果]从不同海拔地区的根际土壤中共分离得到128个菌株,其中有拮抗效果的有55株,平皿拮抗效果强的有15株,再经拮抗系数比较得到9株强拮抗菌菌株,最后筛选出l株杀菌率达98％、破坏冰核蛋白能力达100％的拮抗菌BL-36.[结论] BL-36既有杀菌效果又有破坏冰核蛋白能力,是具有较好利用前景的防除诱发枇杷霜冻害冰核细菌、减轻枇杷霜冻害的生物防治材料.     

我国生物冰核研究进展

我国从1986年起开展了冰核活性细菌的研究,已取得一定的进展。查明了我国冰核细菌种类、分布规律、冰核活性强弱程度,明确了影响冰核细菌冰核活性的某些因素和提出了菌种保存方法;验证了冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因素,研究揭示冰核细菌、低温强度和植物霜冻害三者的关系,并进行了药剂和生物防霜新技术研究;利用冰核细菌研制成功了冰蛋白降水催化剂,开展了促冻杀虫、克隆了编码冰蛋白的冰核活性基因及有关冰核细菌分子生物学应用技术研究;首次报道了大麦黄矮病毒冰核活性,对揭示未知生物冰核种类有一定意义。     

马尾松毛虫肠道细菌的分离鉴定与产蛋白酶细菌的筛选

为分离鉴定马尾松毛虫幼虫肠道细菌,从中挖掘产蛋白酶的肠道细菌资源。以马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)幼虫为材料,通过常规细菌培养方法体外获得部分肠道细菌,利用16S rDNA鉴定细菌种类,采用酪蛋白选择培养基筛选具有产蛋白酶能力的菌株,依据GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》的检测方法,测定蛋白酶活性。结果表明:从马尾松毛虫肠道分离出18个不同种类的非厌氧细菌,隶属于厚壁菌门(Firmicutes)的芽孢杆菌属(Bacillus),变形菌门(Proteobacteria)的亚硫酸杆菌属(Sulfurobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)。经酪蛋白选择培养基筛选后共获得6株产蛋白酶细菌,均为芽孢杆菌。酶活性测定结果显示:这些产蛋白酶细菌均具有较高的产蛋白酶能力,尤其是菌株MW-39地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),酶活...     

水稻稻瘟病拮抗细菌的筛选与鉴定

为筛选并鉴定水稻稻瘟病拮抗细菌,采用平板测定法筛选拮抗细菌,通过形态学观察、生理生化特征及16SrDNA序列分析鉴定菌株.结果表明:从水稻叶片、稻田土壤中共分离得到168株细菌,其中26株对稻瘟病菌有拮抗作用,8株具有强拮抗作用的菌株有,8个代表性的菌株对水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌均表现了强的拮抗作用.选择拮抗性能最强的一个菌株T61,鉴定结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).本试验所筛选的枯草芽孢杆菌对3种主要的水稻真菌病害有显著的抑制效果.     

冰核细菌的定量分离研究

 冰核细菌可能是自然界中诱发和加重霜冻敏感植物发生霜冻害的重要原因之一。由于单个的冰核细菌细胞并不具有冰核活性,因此,研究植物上冰核细菌的种群数量或密度是研究冰核细菌与植物霜冻害关系的关键。从云南省的元江、寻甸、河口、呈贡、临沧、陆良、宣威、曲靖、富民、昆明市官渡区及越南老街等地采集到108种植物共166个标样中,有45个标样分离共到71株冰核细菌,标样中冰核细菌的检出率为27.1％,最低密度为6.0×10⁴ CFU/g,最高密度为5.12×10⁹ CFU/g。其余121个标样经再次分离未检测冰核细菌,占总标样数的72.9％。在云南植物上,用稀释平板法可检测冰核细菌的最低密度为2.0×10⁴ CFU／g.     

防治软腐病的魔芋内生细菌的筛选与鉴定

本研究采用相似生境分离方法分离魔芋内生细菌后经室内平板初筛、温室复筛试验筛选获得对魔芋软腐病具有良好防治效果的生防菌。研究共分离出127株内生细菌,经过多重筛选后获得3株抑菌效果较好的生防菌(M3,M2,1-7)。经培养性状、菌落形态观察、生理生化特性分析(Biolog系统)和16S r DNA序列分析等方法,将M3,M2,1-7分别鉴定为:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和成团泛生菌(Pantoea agglomerans)。这是将寄主植物内生细菌作为生防菌防治该病害的首次报道。     

草地早熟禾根际磷细菌的分离与鉴定

利用选择性培养基从草地早熟禾(Poa pratensis)根际土壤中筛选到8株有机磷细菌和7株无机磷细菌,根据其形态学和生理生化等特性进行了鉴定。结果表明,有机磷细菌菌株PO1、PO3、PO4、PO5鉴定为Bacillus cereus(蜡状芽孢杆菌),菌株PO2、PO6和PO7鉴定为Bacillus megaterium(巨大芽孢杆菌),菌株PO8为Bacillus badius(栗褐芽孢杆菌),而本试验筛选到的无机磷细菌菌株均为Pseudomonas sp.(荧光假单胞菌)。     

1株高冰核活性细菌的分离与鉴定

从发生冻害的植物组织中分离到1株冰核细菌MB03,该菌株在-3℃时在2 min内的冻结率达到96.5%,而产生1个冰核所需要的细胞数约为2.9×103个,其冰核活性明显高于冰核细菌标准菌株和其它分离菌株.进一步对MB03进行了鉴定,经个体形态与培养特征观测、部分生理生化反应、G C摩尔分数测定、16SrDNA序列对比分析、菌落原位杂交探测特异性基因和PCR扩增冰核基因等鉴定,确定该菌为丁香假单胞菌(P5eudomonas syringae).     

拮抗细菌对烟草黑胫病的防治效果研究

采用温室盆栽试验测试5株芽孢杆菌属生防细菌对烟草黑胫病的拮抗作用。结果表明,拮抗细菌芽孢杆菌1205对苗期烟草黑胫病有较稳定的防治效果,其分泌物还有促进烟株生长的作用,经鉴定1205菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。     

泽兰实蝇幼虫内生细菌的分离鉴定及除草活性研究

利用细菌形态特征和16S r DNA序列分析方法鉴定了泽兰实蝇(Procecidochares utilis Stone)幼虫内生细菌的种类,并通过圆叶片法初步研究了这些内生细菌对紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)叶片的侵害作用。从泽兰实蝇幼虫体内共分离了22株菌,并鉴定出21种,分属于10个属:迪茨菌属(Dietzia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、泛菌属(Pantoea)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、莫拉菌属(Moraxella)、红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克吕沃尔菌属(Kluyvera)。ZLSY2、ZLSY5、ZLSY15、ZLSY16、ZLSY20、ZLSY22这6株菌对紫茎泽兰的叶片有显著的侵害作用。     

泽兰实蝇幼虫内生细菌的分离鉴定及除草活性研究

利用细菌形态特征和16S r DNA序列分析方法鉴定了泽兰实蝇(Procecidochares utilis Stone)幼虫内生细菌的种类,并通过圆叶片法初步研究了这些内生细菌对紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)叶片的侵害作用。从泽兰实蝇幼虫体内共分离了22株菌,并鉴定出21种,分属于10个属:迪茨菌属(Dietzia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、泛菌属(Pantoea)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、莫拉菌属(Moraxella)、红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克吕沃尔菌属(Kluyvera)。ZLSY2、ZLSY5、ZLSY15、ZLSY16、ZLSY20、ZLSY22这6株菌对紫茎泽兰的叶片有显著的侵害作用。     

北京地区杏树冰核活性细菌种类及其消长动态规律的研究

 【目的】弄清冰核活性细菌（INA细菌）在杏树上分布种类及分布与年消长动态规律，对于通过防治INA细菌防御杏树晚霜冻害具有重要的意义。【方法】对北京杏主产区27个杏栽培品种及山杏进行调查，采用形态及生理生化方法进行种类鉴定，采用小液滴冻结法测定冰核活性。【结果】共分离到22株-5℃有活性INA细菌菌株，被确定为2个属中的3个种： 假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv.syringae）10株，占45.5%；成团泛生菌（Pantoea agglomerans）9株，占40.9%；凤梨泛生菌噬夏孢子致病变种（Pantoea ananas pv.uredovora）3株，占13.6%。成团泛生菌为杏树上首次发现的INA细菌，‘玉巴达’杏树上的INA细菌（P. agglomerans）数量分布存在3个高峰期：花期（3月末至4月初）、果实发育期（5至6月初）、越冬初期（12月），夏秋季及寒冬难以分离到INA细菌。【结论】INA细菌分布数量与杏树所处地理位置及生态条件有关，杏不同器官上分离到的INA细菌的频率也存在差异。     

拮抗杉木致害菌Fusarium oxysporum海洋细菌3728的生物学特征及其鉴定

从南海红树林木榄(Bruguiera gymnorrhizo)根际土壤中分离到一株具有拮抗杉木致害菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型SF2(Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum)活性的海洋细菌3728菌株,对分离菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列进行了系统的研究。发现细菌3728与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)序列相似性最高,达到100%,在系统进化树中与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis AJ276351)处于同一分支上,结合形态和生理生化分析结果,将其鉴定为枯草芽孢杆菌。     

木香根腐病生防细菌的筛选与鉴定

以木香根腐病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为指示菌,采用平板对峙培养法,从分离自健康木香植株根际土壤的324株细菌菌株中筛选具有拮抗作用的细菌,得到了2株拮抗效果好且具有较好稳定性的菌株at-21和at-97,抑菌率分别为66.8%和78.6%.在显微镜下观察发现,两株拮抗菌株对病原菌的菌丝生长有一定的抑制作用.经形态学观察、生理生化分析和16S rDNA碱基序列分析,鉴定菌株at-21为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis,菌株at-97为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.     

一株小叶榕抗菌内生细菌的分离、筛选和鉴定

从小叶榕茎段和叶片中分离、筛选和鉴定抗菌活性内生细菌,以开发生物防治菌剂。采用组织块法和组织匀浆法分离内生菌,杯碟法和菌落生长速率法检测内生细菌的抗菌活性,通过培养特征和菌体形态观察、生理生化特性试验、16S rDNA序列测定和系统发育树的构建鉴定内生菌。结果表明,从小叶榕植物样本中分离得到的一株内生细菌QYPT-B01的发酵滤液对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和黑曲霉有较强的抑制作用,经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),今后可进一步研究该内生菌发酵液中活性物质的组分及对植物病原菌的拮抗作用。