牛微小隐孢子虫子孢子表面抗原p23基因的克隆及原核表达

从已构建的牛微小隐孢子虫子孢子cDNA文库中,用PCR方法扩增出子孢子表面抗原p23基因,将其插入到编码谷胱肽转移酶(GST)的质粒(pGEX-4T-2)多克隆位点,构建原核表达载体pGEX-p23。重组质粒经EcoRI/Sal I酶切、测序鉴定后转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达蛋白。结果成功构建了pGEX-p23原核表达载体,经IPTG诱导,转化的大肠杆菌表达出分子质量为47kDa的GST融合蛋白,且该蛋白能与抗p23抗体发生特异性结合反应。本研究为进一步研究p23的生物学功能和临床应用奠定了基础。     

HSV_1-TK基因原核表达载体的构建及表达检测

探讨自杀基因HSV1-TK原核表达情况,为进一步将细菌载体应用于肿瘤基因治疗奠定基础。首先以质粒pHSV-106为模板,通过PCR获得HSV1-TK基因克隆并将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接,重组质粒经鉴定后将其转化到E.coli BL21,观察其蛋白表达情况。结果表明,TK基因全长1 128 bp,与理论值相符。经测序发现插入到载体pGEX-6P-1上的DNA片段与TK基因的同源性为100%;SDS-PAGE可明显看出大小为41 ku的TK酶表达,并随时间的延长表达量不断增加。试验证明来源于单纯疱疹病毒的胸苷激酶能够实现原核表达,这一结果是应用细菌载体携带自杀基因TK治疗肿瘤的前提。     

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30基因的克隆及原核表达

以载有银田牌长白苦瓜MAP30基因(YT-MAP30,Genebank accession No:DQ643968)的质粒DNA(pMD-YT-MAP30)为模板,PCR扩增其成熟肽编码区YTm-MAP30,与原核表达载体pET-30a(+)连接构建重组表达质粒pET-YTm-MAP30,酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS感受态细胞,菌落PCR筛选鉴定阳性菌落。30℃培养阳性菌落,IPTG诱导表达不同时间,其表达产物用SDS-PAGE检测并进行可溶性分析。DNA测序结果表明重组质粒pET-YTm-MAP30中YTm-MAP30的序列和插入位点正确。SDS-PAGE分析结果显示IPTG诱导4 h后在35 kD处出现一条增加的表达蛋白条带,且以可溶形式表达。为应用原核表达系统生产MAP30蛋白提供了实验依据。     

犬副流感病毒NP基因的克隆与原核表达

以犬副流感病毒RNA为模板,采用RT—PCR方法,连接pMD18-T载体获取NP蛋白编码基因核苷酸序列,并应用定向克隆技术,构建原核表达载体pGEX-6P-1-NP。经测序鉴定证实获取的NP蛋白核苷酸序列与GeneBank中标准序列存在两处碱基变异,导致编码的蛋白质出现一个氨基酸的变异。测序结果表明,克隆出的目的基因序列已定向克隆到pGEX-6P-1载体,成功构建了其原核表达载体,并能在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达。Westen—Blotting分析结果显示,表达的GST—pGEX-6P-1-NP重组融合蛋白为82．1kDa,可被犬副流感阳性血清所识别,表明NP基因所编码的蛋白具有一定的免疫活性。     

鸡VEGF基因的克隆及融合蛋白的表达与分离纯化

为获得鸡VEGF基因片段,原核表达GST-cVEG基因,并对融合蛋白进行分离纯化,应用RT-PCR从鸡睾丸中扩增出VEGF片段,将PCR产物克隆至pMD 18-T载体.随后,将cVEGF片段亚克隆至带有GST的原核表达载体pGEX-4T-2中,测序鉴定.将重组质粒pGEX4T2-cVEGF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化,纯化产物以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,结果表明,成功地构建了原核表达质粒pGEX4T2-cVEGF.GST-cVEGF融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,Ni-NTA Agarose纯化后得到较纯的蛋白.Western blot分析证实,纯化后蛋白是GST-cVEGF融合蛋白,为进一步研究CST-cVEGF融合蛋白疫苗抗小鼠肿瘤模型奠定了基础.     

大肠杆菌γ-ggt原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt的构建及其蛋白表达

构建大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt及表达与鉴定目的蛋白,为进一步利用该酶催化合成茶氨酸等目的产物奠定了基础。以大肠杆菌DH5α总DNA为模板,用PCR法在γ-ggt编码序列上下游引入酶切位点并扩增出γ-谷氨酰转肽酶基因;将γ-ggt编码序列克隆入原核表达载体pGEX-4T-1的相应酶切位点;用PCR鉴定重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt,并对插入基因片断测序;重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导后用SDS-PAGE分析表达产物,并经Westernblot鉴定。获得大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶基因,并成功构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化有pGEX-4T-1/γ-ggt工程菌BL21(DE3)经1 g/L乳糖诱导1 h后即开始表达目的蛋白,在诱导6 h后表达蛋白量达到最高,随着时间的延长,目的蛋白没有被降解,此蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot鉴定了此目的蛋白。成功构建了大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt,并进行了目的蛋白的鉴定。     

禽流感病毒PA基因的原核表达载体的构建及鉴定

以重组质粒pcDNA-PA为模板扩增PA全基因,并构建原核表达载体pGEX-6p-1-PA。根据GenBank公开发表的禽流感病毒PA基因的序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pcDNA-PA中扩增禽流感病毒的PA基因,将该基因定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1中,然后将连接产物转化宿主菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR和BamHⅠ、NotⅠ双酶切鉴定并测序。测序结果表明,禽流感病毒PA基因全长2151 bp,编码717个氨基酸,原核表达载体pGEX-6p-1-PA已构建成功。从而为禽流感蛋白PA的表达及其多克隆抗体的制备奠定了基础。     

三黄鸡STING胞外区基因克隆及原核表达

[目的]克隆鸡干扰素基因刺激蛋白(STING)胞外区基因并进行原核表达,为了解STING蛋白的生物学功能及探讨禽类的固有免疫机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增鸡STING胞外区基因,与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组表达质粒,再转化BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行12% SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析.[结果]三黄鸡STING胞外区基因全长951 bp,与原核表达载体pGEX-4T-1可成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-STING,转化BL21 (DE3)感受态细胞后经1.0 mmol/L IPTG诱导表达4h,12% SDS-PAGE电泳检测得到一个带GST标签约62 ku的融合蛋白,采用抗GST多克隆抗体进行Western blotting鉴定,约在62 ku处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明目的蛋白原核表达正确,且特异性较高.[结论]从三黄鸡外周血淋巴细胞中克隆获得的STING胞外区基因片段可在原核细胞中高效表达,且纯化后的融合蛋白可用于制备鸡STING多克隆抗体.     

猪丹毒丝菌CbpB基因的克隆表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

利用表达纯化的猪丹毒丝菌(ER)胆碱结合蛋白B(CbpB)建立一种检测ER抗体的间接ELISA方法.克隆扩增ER的CbpB基因并与原核表达载体pGEx-6P-1连接,经PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入E.coil BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot鉴定产物.以纯化重组Cb...     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.     

蜡梅花香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

[目的]研究蜡梅花香基因SAMT cDNA的克隆及表达。[方法]以蜡梅花瓣总RNA为模板进行RT-PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收RT-PCR产物,将其与PMD18-T载体进行T-A克隆连接并导入大肠杆菌DH5α,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。[结果]测序证实成功克隆得到蜡梅花香基因SAMT cDNA的ORF片段,其长度为1 196 bp,编码380个氨基酸残基,与已报导的蜡梅SAMT(ABU88887)的同源性为99.2%。将SAMT基因亚克隆到原核表达载体PGEX4T-1中获得重组菌种命名为PGSAMT,用0.01 mol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,SAMT的融合表达蛋白分子量约为66 kDa,与预期的26 kDa的GST带和42.3 kDa的蜡梅SAMT基因编码蛋白构成的融合蛋白大小接近。[结论]该研究成功克隆并表达蜡梅花香基因SAMT。     

人促凋亡蛋白基因bax的克隆与原核表达

以人促凋亡蛋白基因bax全长转录本eDNA为模板,经PCR扩增得到bax基因,将其克隆到pMD18-T,并构建原核表达质粒栽体pGEX-4T-1-Bax,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达.PCR扩增、双酶切鉴定他测序结果均显示bax基因已被成功克隆到表达载体中,表这产物经SDS-PAGE检测,证实为GST-Bax融合蛋白.     

Smad家族成员2/3/4原核表达载体构建和融合蛋白纯化

目的 构建针对Smad家族相关系列原核表达载体,观察其相应蛋白诱导表达纯化情况.方法 PCR扩增Smad2/3/4全长及截短片段,定向插入pGEX-6P-1载体中,构建原核表达重组质粒pGEX-6P-1-Smad2/3/4.经酶切和测序正确后,重组质粒转化表达菌株BL21(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;上清经GST-Sepharose4B亲和纯化,SDS-PAGE考-马斯亮蓝染色鉴定.结果 原核表达载体pGEX-6P-1-Smad2/3/4构建成功,SDS-PAGE证实Smad3A和Smad4存在包涵体,而上清中GST-Smad3(B-D)和GST-Smad2可被纯化.结论 构建的融合蛋白原核表达载体通过诱导和纯化后得到GST-Smad3截断融合蛋白(B-D)和GST-Smad2.     

核蛋白Sam68的原核表达及鉴定

为了构建pGEX-4T-1-Sam68原核表达载体,表达并鉴定GST-Sam68融合蛋白,采用PCR扩增Sam68基因,插入pGEX-4T-1的Eco R I和Sal I位点,并转化Rosetta(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot验证蛋白表达,GST pull-down技术验证Sam68的结合活性。酶切和测序结果证实Sam68基因正确插入pGEX-4T-1载体中,载体能够在Rosetta(DE3)细胞中正确表达,且纯化的GST-Sam68蛋白具有与PI3K p85特异结合的活性,说明成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-Sam68。     

蜡梅花香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达(英文)

[目的]研究蜡梅香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达。[方法]以蜡梅花瓣总RNA为模板进行RT-PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收RT-PCR产物,将其与PMD18-T载体进行T-A克隆连接并导入大肠杆菌DH5,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。[结果]测序证实成功克隆得到蜡梅花香基因SAMTcDNA的ORF片段,其长度为1196bp,编码380个氨基酸残基,与已报导的蜡梅SAMT(ABU88887)的同源性为99.2%将SAMT基因亚克隆到原核表达载体PGEX4T-1中,转化大肠杆菌DH5α获得其原核表达菌株pGSAMT;采用0.01mol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,SAMT的融合表达蛋白分子量约为66kDa,与预期的26KDa的GST带和42.3KDa的蜡梅SAMT基因编码蛋白构成的融合蛋白大小接近。[结论]该研究成功克隆并表达了蜡梅花香基因SAMT。     

水稻HL-CMS育性恢复蛋白的原核表达及纯化

将水稻目地基因Rf6连接到载体PMD-18T上,测序正确后将目的片段连接到含有GST标签的p GEX-6P-1原核表达载体上,确认正确的重组质粒转化到BL21菌株;通过LB培养至对数生长期后,加入IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测是否诱导出目的条带,并且经过Glutathione Resin亲和层析系统纯化及检测。结果表明,20℃,4 h,0.3 mmol/L IPTG条件下可诱导出可溶性蛋白,经纯化得到可溶性带GST标签的融合蛋白。     

马立克氏病病毒gE基因在大肠杆菌中的融合表达

以马立克氏病病毒(MDV)特超强毒648株基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出gE基因。将其插入到表达性质粒pGEX-6p-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,转化大肠杆菌,经筛选、鉴定获得重组质粒,测序结果证明重组质粒的阅读框架不变,将其命名为pG648E。经SDS-PAGE电泳及Westernblotting分析,在82ku有GST-gE的蛋白带,重组质粒在大肠杆菌BL21中以融合蛋白的形式表达。结果表明:MDVgE基因原核表达成功。     

鸡干扰素α受体Ⅱ胞外域的克隆及GST融合蛋白原核表达

应用RT-PCR技术扩增鸡干扰素α受体Ⅱ胞外域（CHIFNAR2 EC）基因片段,将扩增产物克隆至pMD-18T,转化J M109感受态。重组质粒与表达载体pGEX-6P-1经双酶切后构建重组表达质粒pGEX-6P-CHIF-NAR2EC,转入BL21,提取质粒酶切和测序鉴定。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99%。用IPTG诱导表达,对诱导条件进行初步优化,表达蛋白主要以包涵体的形式存在。通过切胶的方法进行纯化,获取具有较高纯度的融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测显示融合蛋白分子量大小约为50 KD,采用抗GST抗体进行Western Blot,成功检测到特异性目的条带。     

A型流感病毒PB1-F2蛋白的原核表达、纯化及鉴定

对A型流感病毒PB1-F2蛋白进行了原核表达及纯化,获得了谷胱甘肽硫转移酶(GST)-PB1-F2融合蛋白,以用于研究流感病毒PB1-F2蛋白的功能及分子作用机制。以RT-PCR方法扩增PB1-F2基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上。重组质粒pGEX-6P-1-PB1-F2转化大肠杆菌(Es-cherichia coli)菌株BL21,并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot试验鉴定。结果显示,大肠杆菌细胞经诱导,表达出了相对分子量约为36kDa的蛋白,与GST-PB1-F2融合蛋白大小相符;Western blot鉴定显示,该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别。试验在大肠杆菌表达系统中成功表达纯化了GST-PB1-F2融合蛋白,为深入研究PB1-F2蛋白的功能奠定了基础。     

aiiA基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建aiiA基因的原核表达载体,并进行诱导表达,检测aiiA蛋白的抗病性,为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】从pMDTM19-T Vector+aiiA质粒中酶切获得aiiA基因,将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA,经双酶切及测序鉴定后,进行诱导表达,并对表达产物的功能进行鉴定。【结果】双酶切与PCR检测结果表明,重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA构建成功。表达条件优化结果表明,在25℃下用0.2mmol/L IPTG诱导9h,aiiA蛋白的表达量最高。aiiA重组蛋白抑菌试验结果表明,其能够降解细菌的AHLs信号分子,猝灭细菌的群体感应,明显减弱病菌的致病力。转aiiA基因尾巨桉抗性检测结果表明,转基因植株抗性明显增强,表现为发病时间延迟,病情指数降低,评价为中等抗病水平。【结论】成功构建了aiiA基因原核表达载体,其诱导表达产物能猝灭细菌的群体感应,明显减弱病菌的致病力。