草莓MYB类转录因子FaMYB5基因的克隆与表达分析

以丰香草莓（Fragaria ×ananassa cv. Toyonaka）为试材,通过同源克隆技术获得FaMYB5基因全长编码序列,运用生物学软件对该序列进行相关生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR方法对FaMYB5基因在果实不同发育阶段的表达模式进行研究。FaMYB5基因的cDNA全长为822 bp,编码273个氨基酸,蛋白质分子量为29159 ku,等电点为5709,与森林草莓的FvMYB5同源性达957%。实时荧光定量PCR分析显示,随着果实发育成熟,FaMYB5基因的表达逐渐上升。在果实的小绿期（SG）,FaMYB5基因的表达量最低。但是在白果期（WT）出现1个降低的峰值,其表达量略高于小绿期,草莓果实开始转红时其表达量又逐渐上升,在果实全红期（FR）达到最大。结果获得了丰香草莓MYB类转录因子FaMYB5基因的cDNA全长,其表达存在差异。     

人参达玛烷二醇合成酶基因的克隆、序列特征和组织表达分析

以五年生人参根组织为试验材料,利用RT-PCR方法克隆人参DS基因序列;通过生物信息学技术对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比对;运用实时荧光定量PCR技术检测DS基因在人参根、茎、叶、果各部位的表达量。结果表明:获得人参DS基因c DNA全长,其核苷酸序列长为2.385 kb,含有1个开放阅读框,编码769个氨基酸多肽。生物信息学分析显示DS编码蛋白质包含1个跨膜区域,具有3个保守结构域。人参DS编码蛋白质与西洋参的DS(AGK62449)和三七的DS(AGI19258)具有99%的序列相似性。实时荧光定量PCR显示,DS基因在人参根、茎、叶、果各部位均有表达,在叶中表达量最高,其次是在果中,在根和茎中表达量相近。     

桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

[目的]克隆桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(PpZDS)的全长序列,并对其进行生物信息学及表达分析,为研究桃果实类胡萝卜素生物合成的分子机理提供参考.[方法]从黄肉品种桃果实中克隆PpZDS基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在桃果实不同成熟期的表达情况.[结果]克隆获得的PpZDS基因全长2014 bp,具有完整的编码区,长度为1716 bp,编码571个氨基酸.PpZDS蛋白含有ZDS特征序列(KVAIIGA-GLAGMSTAVELLDQGHEVDIYESR),属于NAD_binding_8超级家族保守结构域.PpZDS蛋白与同为蔷薇目的苹果(gi|33313474)和草莓(gi|256041892)的ZDS蛋白亲缘关系较近,物种间分化程度较小.整个桃果实成熟期PpZDS基因在果肉和果皮中均有表达,从软核期至硬熟期均呈逐渐升高趋势,硬熟期达最高,完熟期降低;不同桃果实发育期果肉中的PpZDS基因表达量均大于果皮中表达量,其中硬核期、硬熟期和完熟期的桃果实中PpZDS基因在果肉中的表达量显著高于果皮中的表达量(P<0.05).[结论]PpZDS基因表达对桃果实类胡萝卜素生物合成及呈色发挥正向调控作用.     

红花查尔酮异构酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

【目的】克隆红花(Carthamus tinctorius L.)黄酮合成途径中的关键酶查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的全长序列,研究其组织表达特异性,为红花代谢调控研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆CHI基因的cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析CHI基因在红花不同开花时期的表达量。【结果】CHI基因全长1 161bp,开放阅读框长654bp,编码217个氨基酸,理论分子质量约为23.14ku,等电点为5.67,序列含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly(A)。系统发育树表明,该基因与其他物种CHI基因具有较高的同源性,其中与青木香的同源性最高,达到82%。实时荧光定量PCR结果表明,CHI基因在红花花蕾期的表达量最高。【结论】克隆得到了红花CHI基因,其在红花花蕾期的表达量最高。     

桃果实番茄红素β-环化酶基因的克隆及表达分析

以黄肉品种桃果实‘金丽’为试验材料,利用同源序列克隆技术获得桃果实番茄红素β-环化酶(LCYb)基因的全长核苷酸序列,命名为PpLCYb。PpLCYb全长1 699bp,编码区长度1 515bp,编码504个氨基酸。进化树分析发现PpLCYb与草莓FaLCYb亲缘性较高。氨基酸序列分析表明PpLCYb含有特征序列LYAMPF及NAD(P)/FAD结合区,属于SDR超级家族。实时荧光定量PCR结果显示PpLCYb基因在桃果实中的表达总体呈现上升的趋势,并在果实处于硬熟期时达到较大值,随后在完熟期略有下降。桃果实PpLCYb基因的克隆及表达分析可为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机制奠定良好的基础。     

黄肉桃果实八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆及表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的全长核苷酸序列,命名为PpPDS。PpPDS全长2 056bp,编码区长度1 722bp,共编码573个氨基酸。进化树分析发现PpPDS与杏果实PaPDS、草莓FaPDS亲缘性较高。蛋白质序列分析表明PpPDS含有二核苷酸[NAD(H)/NADP(H)或FAD(H)]结合基元,其处于NAD(P)-binding Rossmann-like保守结构域内。实时荧光定量PCR结果显示,PpPDS基因在黄肉品种‘金丽’桃果实发育过程中均有表达,且在果肉中的表达普遍高于果皮。果实处于硬核期的PpPDS基因在果实中的表达显著高于软核果时期,随后其表达处于较高水平并呈平缓趋势。本研究对桃果实PpPDS基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。     

‘辽宁2号’DELLA蛋白编码基因的克隆及表达分析

以‘辽宁2号’核桃的叶片为试材,通过同源克隆和RACE技术克隆DELLA家族蛋白的编码基因,并进行了同源性分析和氨基酸序列的多重比对;通过实时荧光定量PCR分析了该基因在‘辽宁2号’核桃中的组织特异性表达情况。主要研究结果如下:获得了DELLA蛋白编码基因的cDNA全长,命名为JrGAI(Genebank:JF766606),cDNA全长为2 361bp,包含1 842bp编码区序列,推测其编码的蛋白包含613个氨基酸,分子量为66.78kDa。同源性分析及氨基酸序列的多重比对结果表明该蛋白与其他物种的DELLA蛋白高度相似,并且具有完整的DELLA、TVHYN、VHIID、RVER和SAW等结构域;实时荧光定量PCR结果显示JrGAI基因在‘辽宁2号’核桃的叶芽、混合花芽、叶片、雄花、茎段和果实中普遍表达,并且在休眠期组织中具有较高的表达量,其中以休眠期的混合花芽中的表达量最高。     

甜瓜CmERFIV-5基因cDNA的克隆·表达分析及载体构建

[目的]研究甜瓜Cm ERFIV-5基因的克隆、表达分析及超表达和RNAi载体构建。[方法]根据Gen Bank上登录的甜瓜一个乙烯应答因子(ethylene responsive facter,ERF)基因c DNA序列(登录号:MELO3C024315)设计合成特异性引物。应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumismelo L.cv.Hetao)成熟果实中克隆得到该基因c DNA序列,命名为Cm ERFIV-5,分析了该基因在甜瓜根、茎、叶及果实发育过程中的表达特性,将其构建到过量表达载体p PZP221中,得到重组植物表达载体p PZP221-Cm ERFIV-5。同时,构建了该基因RNAi载体p ART-27-Cm ERFIV-5。[结果]序列分析显示,所克隆的c DNA长度为808bp,编码255个氨基酸。荧光实时定量PCR分析表明,Cm ERFIV-5基因在甜瓜根、茎、叶及不同发育时期的果实中均有表达,在叶片中表达量最高。[结论]构建了Cm ERFIV-5基因的过量表达载体与RNAi载体,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

草莓乙烯响应因子FaERF003基因克隆与表达模式分析

[目的]为了探明乙烯响应因子FaERF003在草莓果实成熟中的作用.[方法]转录组测序和实时荧光定量PCR检测FaERF003基因在草莓果实不同发育时期的表达水平,利用生物信息学方法分析FaERF003 DNA结合域的氨基酸序列与蛋白质结构,烟草叶片瞬时转化分析FaERF003亚细胞定位.[结果]FaERF003基因CDS区全长894 bp,编码297个氨基酸,预测FaERF003蛋白的分子量为32.9 kD,等电点为8.55,属于AP2/ERF蛋白超家族.FaERF003在草莓果实成熟过程中表达迅速升高且与乙烯前体ACC含量变化趋势相似,推测该基因与乙烯信号转导相关.FaERF003蛋白定位于细胞核和胞质.[结论]FaERF003可能作为乙烯响应因子与乙烯调控草莓果实成熟密切相关.     

唐菖蒲丙二烯氧化物环化酶基因GhAOC的克隆与表达分析

克隆唐菖蒲AOC基因的全长cDNA序列,并分析该基因的表达模式及其对茉莉酸(Jasmonic acid,JA)生物合成的影响。以唐菖蒲栽培品种‘Rose Supreme’的球茎为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆AOC基因的全长cDNA序列;利用基因枪方法进行GhAOC基因的亚细胞定位分析;运用实时荧光定量PCR技术分析GhAOC基因的表达模式。克隆了1个全长为898bp的茉莉酸生物合成关键酶丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase,AOC)基因的cDNA序列,命名为GhAOC。该序列含有1个735bp的开放阅读框(ORF),编码244个氨基酸,推导的蛋白质分子量为26.52ku。亚细胞定位分析表明GhAOC是叶绿体蛋白。实时荧光定量RT-PCR表达分析显示,该基因在唐菖蒲叶、花、根、匍匐茎、新球茎和籽球上都表达,其中在新球茎和籽球中表达量最高;经过0.1～0.5mmol/L的MJ(methyl jasmonate,茉莉酸甲酯)处理后,逐渐提高了GhAOC基因在球茎中的表达量和内源MJ含量。GhAOC基因的表达促进了唐菖蒲茉莉酸的生物合成。     

鸭TTR基因cDNA克隆和表达研究

为研究转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)与肉鸭脂肪代谢的相关性,通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)获得北京鸭TTR基因全长cDNA序列,并采用实时荧光定量PCR法对鸭TTR基因表达谱进行研究。结果显示:鸭全长TTRmRNA编码150个氨基酸的前体肽,该肽含20个氨基酸的信号肽和130个氨基酸的成熟肽;与哺乳动物相比,鸭TTR亚基N-末端序列多出的3个氨基酸Val-Ser-His,可能使鸭TTR结合甲状腺素T3的亲合力增加。定量检测结果表明,鸭TTRmRNA在脉络丛中的表达量最高,与鸡、爬行类和哺乳动物类似。本实验证实鸭TTR基因在脉络丛中的表达量比鸡更高,并首次发现TTRmRNA在鸭皮下脂肪组织中表达。     

草莓果实查尔酮异构酶基因克隆及表达分析

【目的】探明查尔酮异构酶基因对草莓果实着色的影响。【方法】从八倍体草莓(Fragaria×ananassa)转录组数据筛选比对出差异表达基因查尔酮异构酶(chalcone isomerase)基因FaCHI,利用RTPCR技术从‘红颜’草莓克隆出CHI基因,测序得到其编码序列并进行生物信息学分析,实时荧光定量qRTPCR分析在草莓着色过程中该基因的表达水平。【结果】FaCHI基因开放阅读框714bp,编码氨基酸237个。生物信息学分析表明:分子量约为25.4kDa,理论等电点(pI)为5.31,该基因具有一个查尔酮合酶超家族保守序列,进化树分析表明‘红颜’草莓FaCHI与八倍体草莓(登录号:Q4AE12.1)亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示:FaCHI基因在草莓果实大绿期(花后14d)到白果期(花后21d)表达量下调,随着果实颜色的加深表达量逐渐升高,全红期(花后28d)表达量最高。【结论】FaCHI基因在草莓果实着色过程中发挥重要作用。     

苹果GMP、GME和GGP基因的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)、GDP-甘露糖-3′,5′-表异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和GDP-1-半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。     

金线莲呋甾皂苷26-O-β-葡萄糖苷酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆金线莲(Anoectochilus roxburhii)ArF26G基因的cDNA全长,分析该基因在金线莲茎、叶中的表达模式,以期为进一步了解金线莲甾体皂苷的生物合成代谢调控机制提供参考。【方法】利用RACE技术克隆金线莲ArF26G基因cDNA全长,以pET-28a(+)为载体构建原核表达载体并诱导表达,采用荧光定量PCR方法分析不同温度(5、15、25、35℃)和种植时间(1–6个月)ArF26G基因在茎和叶中的表达水平。【结果】ArF26G基因的cDNA全长1 982 bp,含有1个1 764 bp的ORF,编码587个氨基酸,编码蛋白具有Glycosyl hydrolase1(GH1)superfamily蛋白保守区,定位于叶绿体,N端33个氨基酸残基为叶绿体转运肽,分子量为66.48 kD,理论等电点(pI)为5.31,不稳定系数为37.92,属稳定蛋白。构建了pET-28a-ArF26G原核表达载体,并在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中成功诱导表达。荧光定量PCR分析结果显示,ArF26G基因在茎中的表达量极显著高于叶,25℃处理表达量最高。金线莲种植时间达4个月时,ArF26G基因在茎中的表达量是25℃处理组培苗茎的11.9倍,种植5个月达到23.3倍。【结论】本研究克隆了金线莲ArF26G基因cDNA全长,其表达量在25℃以及种植5个月时表达量最高。     

甜瓜 ERF 转录因子基因 CmERFII-11 cDNA 克隆及表达分析

根据已报道的甜瓜Cm ERFII-11基因c DNA序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从甜瓜果实中克隆得到Cm ERFII-11基因。采用相关分析软件对该基因进行了生物信息学分析,利用荧光实时定量PCR进行表达分析。结果表明,所克隆的c DNA长度为954 bp,编码255个氨基酸,编码蛋白质的分子量为28.33ku,理论等电点为7.62。该基因在根、茎、叶组织以及授粉后不同时期果实中均有表达,在叶片组织中的表达量最高。     

烟夜蛾气味受体OR18基因克隆及组织特异性表达

应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术,从烟夜蛾雄虫触角中克隆气味受体目的基因,分析鉴定了其在烟夜蛾不同组织的特异性表达情况.序列分析结果表明,目的基因为新的烟夜蛾气味受体基因,命名为HassOR18(GenBank登录号:HM750915).该基因阅读框架全长1 197 bp,编码398个氨基酸,推测编码蛋白质的相对分子质量为46.6 kD,等电点为5.82.氨基酸序列比对表明,烟夜蛾气味受体HassOR18与其他夜蛾科昆虫OR18的氨基酸序列一致性均达80％以上.实时荧光定量PCR结果显示,HassOR18仅在雌雄虫触角中和雌虫喙内表达,而且在雄虫触角内的表达量远高于在雌虫触角和喙内的表达量,推测该基因可能参与性信息素的识别.     

杜梨响应盐胁迫CIPK01的克隆及表达分析

CBL互作蛋白激酶(CIPK,CBL-interacting protein kinases)是与钙调磷酸酶B类蛋白(CBL,calcineurin B-like protein)特异结合的蛋白激酶,广泛参与植物的生长发育以及生物和非生物胁迫响应。克隆和鉴定杜梨响应盐胁迫的CIPK基因,对杜梨抗逆分子机制和抗逆性研究具有重要意义。选取了一个特殊的基因PbCIPK01做进一步的研究,通过生物信息学和实时荧光定量PCR技术分析该基因的序列特征以及在盐胁迫下的表达模式。该基因全长为1 368 bp,含有1 365 bp的开放阅读框,编码455个氨基酸,DNA序列为5 051 bp,包含12个外显子和11个内含子。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因在杜梨的叶片中表达量最高,且受盐胁迫诱导下调表达。     

黄毛草莓FnbHLH68转录因子基因和启动子的克隆及表达分析

以黄毛草莓为试材,采用RT-PCR技术克隆了1个碱性螺旋—环—螺旋(bHLH)转录因子基因FnbHLH68的cDNA序列(GenBank登陆号:MN879282).序列分析显示,FnbHLH68基因开放阅读框长1 161 bp,编码386个氨基酸,包含一个保守的碱性螺旋—环—螺旋(HLH)结构域.同源性分析表明,黄毛草莓FnbHLH68氨基酸序列与森林草莓FvbHLH68氨基酸序列的同源性为98.45%.进一步从黄毛草莓基因组DNA中克隆了FnbHLH68上游1 849 bp的启动子序列pFnbHLH68(GenBank登录号:MW218450),预测含有多个响应逆境和激素诱导的顺式作用元件.成功构建了植物过表达载体pCAMBIA1300-HA-FnbHLH68和基因沉默载体pTRV2-FnbHLH68.实时荧光定量PCR检测显示:黄毛草莓叶片接种胶孢炭疽菌12 h后,FnbHLH68基因的表达量达到最高值,为0 h的10.6倍;黄毛草莓叶片用水杨酸处理后,FnbHLH68基因的表达量上升,12 h后达到最高值,为0 h的11.5倍.     

番木瓜泛素活化酶基因CpUBA1 的表达模式分析

通过生物信息学方法从番木瓜基因组中获得一个泛素活化酶基因CpUBA1。利用软件分析该基因的序列特性,同时利用荧光定量PCR技术分析CpUBA1基因在番木瓜果实成熟过程中的表达模式,结果表明,CpUBA1基因序列开放阅读框为3 459 bp,编码的蛋白具有1 152个氨基酸,其分子量为128.93 ku,理论等电点为5.49,定位于细胞核。荧光定量PCR分析发现,CpUBA1基因在番木瓜叶片中的表达量最高,在雌花中的表达量最低。CpUBA1基因在果实成熟过程中呈上调表达模式。     

枸杞酸性转化酶基因的克隆与表达

以枸杞果实为试验材料,利用RACE技术克隆枸杞酸性转化酶基因Lb AI的全长c DNA序列,应用生物信息学软件分析Lb AI预期编码蛋白质特征;采用气相色谱法和实时荧光定量PCR技术,分析不同发育阶段枸杞果实及不同颜色成熟果实中可溶性糖含量及Lb AI在果实中的相对表达量。结果显示:Lb AI的c DNA序列全长2 252bp,开放阅读框(ORF)长1 920 bp,编码642个氨基酸,Lb AI编码的蛋白质相对分子量和等电点(p I)分别为70 600和5.9,Gen Bank登录号为KM191309。进化树分析结果显示,枸杞与马铃薯和番茄的亲缘关系最近,相似性在85%以上。随着果实生长发育,枸杞果实中果糖和葡萄糖含量不断升高,而蔗糖呈现出降低趋势;不同颜色枸杞果实中糖含量差异较大,成熟红色和黄色果实中果糖和葡萄糖含量显著高于黑色果实,但蔗糖含量在黑色果实中最高,在红色果实中最低;Lb AI相对表达与果实中葡萄糖含量变化基本一致。表明Lb AI基因在枸杞果实糖积累过程中具有重要的作用。