包涵体蛋白的复性研究进展

介绍了包涵体的洗涤、变性溶解和传统的复性方法,详细阐述了包涵体蛋白的层析复性方法以及复性过程中的添加剂效果。     

GST-GnRH/TRS融合蛋白(包涵体)的分离、纯化与复性研究

以人工合成的促性腺激素释放激素(Gonadotropin releasing hormone,GnRH)/转运肽(TRS)基因与表达载体pGEX-6p-1相连的重组子(pGE-G)作为研究对象,转化大肠杆菌BL21(ED3)plyS。本文对GST-GnRH/TRS/BL21(DE3)plyS工程菌的GST-GnRH/TRS重组产物进行了诱导表达和分离纯化的研究,结果表明,该工程菌用LB培养基在30℃扩增至OD590为0.6左右,加IPTG(终浓度为0.2 mmol/L)诱导3.5h,此时GST-GnRH/TRS的表达量可占菌体总蛋白的33.3%。重组产物绝大多数以IBs形式存在于菌体中。工程菌经溶菌酶破碎、高速离心,得IBs粗制品后,再用8 mL 1%(V/V)Triton X-100变性溶解IBs,离心取上清,进行Glutathione Sepharose 4B柱一步法亲和层析,得到了纯度较高的GST-GnRH/TRS融合蛋白,为进一步研究和实际应用奠定基础。     

体外蛋白质复性方法及小分子添加剂在复性过程中的作用

变性蛋白质体外复性的方法主要有传统的辅助复性法包括了:稀释法、透析法、超滤法以及蛋白质折叠液相色谱法(PFLC),也有在此基础上模拟体内分子伴侣、折叠酶、人工分子伴侣、反胶束的辅助复性方法。到目前为止,在复性液中添加小分子试剂是提高体外辅助蛋白质复性效率的策略之一。其目的是为了降低蛋白质复性过程中聚集形式的形成,从而促进变性蛋白质向其天然和活性构象的转变。这种方法在一定程度上能够提高蛋白质的复性效率并且得到了长足的发展。为了捕捉变性蛋白质向其活性结构折叠过程的差异性变化规律,明确小分子添加剂对体外辅助蛋白质分子折叠过程的机制,推测一些小分子添加剂辅助蛋白质色谱复性过程中构象的变化规律,为解决包涵体蛋白质难于复性和复性效率低的问题起到指导性的作用。     

以包涵体形式表达的猪带绦虫六钩蚴重组抗原的复性与纯化

重组蛋白的复性是基因工程下游研究的难题和重点。本文应用夹心 ELISA 测免疫活性及变性与非变性 SDS-PAGE 测重组抗原单体和非单体的方法来评价不同复性条件.透析法复性,透析液为含2mg·kg~(-1)尿素、80μmol/PEG4000,0.1/0.1mmol·L~(-1)GSH/GSSG 的 pH 8.0的0.05mg·kg~(-1)PB,以静置缓慢透析为佳,上述条件任意缺一或快速透析,免疫活性下降,二聚体或多聚体明显增加;稀释法复性,复性液为上     

拟南芥转录因子AGL47的原核表达与包涵体复性研究

AGL47是拟南芥第五染色体上AtSg55690基因编码的1个转录因子,属于MADS-box蛋白质家族,前期研究显示,At5g55690基因受磷胁迫特异诱导表达,极有可能在磷代谢调控中发挥重要的作用.为了进一步鉴定该基因的功能,本研究克隆At5g55690基因全长ORF,构建重组表达载体pPET-28a-At5g556...     

蛋白质的折叠调控与包涵体的形成

新合成的多肽链必须先经折叠和装配后形成特定的三维结构才有活性.分子伴侣和蛋白酶可有效地调控多肽链的正确折叠.然而,在多肽链的折叠过程中,往往也会产生一些折叠异常的蛋白,形成集聚体即包涵体.本文主要对蛋白质的折叠机制、分子伴侣和蛋白酶在折叠中的作用,以及集聚和包涵体的特性、形成机理等做一综述.     

抗伊维菌素scFv蛋白质的变复性及纯化

基因工程技术的发展扩大了蛋白质研究领域,简化了研究步骤。原核表达系统表达目的蛋白质具有操作简单、培养周期短、高效经济、便于纯化等优点,但大部分表达的蛋白质是以包涵体的形式存在。包涵体是蛋白质在细胞内凝集形成的无活性不溶于水的固体颗粒,含有重组蛋白质及核糖体元件、内毒素、外膜蛋白质、RNA聚合酶和脂体等。在高浓度的变性剂如尿素、盐酸胍等中由于氢键、疏水键被破坏,包涵体蛋白质完全伸展而溶解,在复性剂中可重新折叠形成天然结构而重新获得活性[1]。     

苦荞过敏原TBa和TBb基因的共表达及其包涵体复性的研究

[研究目的]利用大肠杆菌共表达苦荞过敏蛋白的两个亚基,并对表达产物进行包涵体复性研究和免疫学活性分析;[方法]用已构建的表达质pET-28a-TBa和pET-32m-TBb,共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,利用双抗生素筛选法,获得稳定遗传的双质粒转化子,经IPTG诱导,两个基因在同一宿主菌中共表达,在共表达产物复性过程中,两个亚基互为分子伴侣,相互促进了蛋白质的重新正确折叠;[结果]表迭蛋白以包涵体的形式存在,ELISA检测表明:复性后的蛋白免疫学活性得到了提高;[结论]由此获得了有活性的蛋白质,并且建立了不相容双质粒共表达外源基因和包涵体复性的方法.     

新孢子虫病P43蛋白质(包涵体)的纯化及rELISA方法的建立

为建立新孢子虫病间接酶联免疫吸附试验(rELISA)检测方法,先诱导表达GST-P43包涵体蛋白,并对其进行提取、纯化、复性处理,再以复性后的P43蛋白作为抗原,优化rELISA检测方法。结果表明,这种包涵体处理方法,可使其纯度达到87%,复性后的目的蛋白具有良好的免疫活性。通过对rELISA各反应条件的优化,确定了最佳反应条件,血清稀释倍数为1∶100,抗原包被浓度为7μg/mL,封闭液为0.5%脱脂乳,酶标抗体的工作浓度为1∶4000,酶标抗体作用时间为1 h,底物作用时间25 min。且该方法不与弓形虫和布鲁氏菌病发生交叉反应。     

拟南芥SEPALLATA3蛋白质原核表达与纯化

SEPALLATA3(SEP3)属于花器官建成ABCE模型中的E类基因,为了揭示SEP3蛋白是如何形成多聚体的,以及多聚体与其生物学功能之间的联系,开展了拟南芥Arabidopsis thaliana AtSEP3蛋白质体外可溶性表达实验,构建了原核表达载体,并在大肠埃希菌Escherichia coli细胞中进行重组蛋白的诱导表达。从蛋白不同的结构域、诱导时间和诱导温度等方面对蛋白的可溶性表达进行了分析。最后以pET-15b为表达载体,大肠埃希菌表达菌株E.coli‘Rosetta’为宿主菌株,22℃诱导表达15 h,获得不同片段的AtSEP3可溶性蛋白。通过镍柱及分子层析色谱柱分离纯化,表明AtSEP3蛋白以四聚体形式存在。图4参13     

鸡包涵体肝炎的病理学研究

介绍了河北省中南部地区１９９４－－１９９５年间,８７个鸡场,３２００万只鸡发生鸡包涵体肝炎的系统病理学研究。结果表明,病鸡发生以肝脏严重变性、坏死,并在肝细胞核内形成核内包涵体的特征性病变。同时,机体免疫器官发生广泛损伤,产蛋鸡生殖器官发迟缓或停滞。     

新疆卡拉库尔羊Fas基因重组蛋白包涵体的纯化及抗原性分析

目的:为了探明Fas基因重组蛋白是否保留天然蛋白的抗原性,为下一步大量制备基础诊断、预防、控制、治疗试剂奠定基础.本实验将Fas基因与原核表达载体pET-28a成功构建了重组融合表达质粒pET-28a-Fas然后转化至E.coliBL21(DE3)感受态当中,找到最佳表达条件,初步纯化了重组融合蛋白,通过对家兔免疫后的血清进行琼扩实验与蛋白质印迹实验分析其抗原性.结果表明,纯化后的包涵体有明显的条带,经测定融合蛋白分子量为39.7 KDa.结论:说明纯化效果好,优化融合蛋白表达量占菌体总蛋白的15.6％,并且证明Fas具有免疫原性和反应原性.     

哈维氏弧菌溶血素的包涵体纯化、多抗制备及活性验证

为进一步研究哈维氏弧菌溶血素(Vibrio harveyi hemolysin, VHH)的生物学功能,构建了vhh原核表达载体,并利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用DOT-ELISA和Western-blot方法检测抗体的效价及特异性,并通过溶血试验评估抗体对哈维氏弧菌培养物上清溶血活性的影响。结果表明:在构建得到的表达菌株pET28a-vhh-BL21(DE3)中,重组蛋白以包涵体形式大量表达;对该重组蛋白进行纯化并复性后,利用纯化的蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体效价为1∶163 840,可特异性识别VHH蛋白,且稀释倍数小于1000时,可显著抑制哈维氏弧菌培养物上清的溶血活性。本研究结果对VHH单抗的制备、哈维氏弧菌检测手段的完善及哈维氏弧菌的疫苗研发具有一定参考作用。     

哈维氏弧菌溶血素的包涵体纯化、多抗制备及活性验证

为进一步研究哈维氏弧菌溶血素(Vibrio harveyi hemolysin, VHH)的生物学功能,构建了vhh原核表达载体,并利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用DOT-ELISA和Western-blot方法检测抗体的效价及特异性,并通过溶血试验评估抗体对哈维氏弧菌培养物上清溶血活性的影响。结果表明:在构建得到的表达菌株pET28a-vhh-BL21(DE3)中,重组蛋白以包涵体形式大量表达;对该重组蛋白进行纯化并复性后,利用纯化的蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体效价为1∶163 840,可特异性识别VHH蛋白,且稀释倍数小于1000时,可显著抑制哈维氏弧菌培养物上清的溶血活性。本研究结果对VHH单抗的制备、哈维氏弧菌检测手段的完善及哈维氏弧菌的疫苗研发具有一定参考作用。     

麻蝇胞浆全蛋白质提取与纯化研究

使用醇提、水提、盐提、碱提获得麻蝇胞浆全蛋白,电泳结果蛋白条带清晰,蛋白含量较高,蛋白质大小位于10～82kD。该方法适合于麻蝇胞浆蛋白质组学研究中纯化总蛋白质,通过家蝇幼虫蛋白质提取过程的研究,为其它昆虫或动物蛋白提取提供了一个可行的实验依据。     

四氢嘧啶对热变性凝乳酶复性作用的研究

[目的]加深对部分失活的凝乳酶复性作用的了解,为热稳定性研究中部分失活态凝乳酶的制备提供参考。[方法]研究了四氢嘧啶存在的条件下,复性时间、热处理时间和热处理温度等因素对凝乳酶复性作用的影响。[结果]随着复性时间的延长,凝乳酶的活力逐渐上升。凝乳酶的复性主要发生在前24 h,36 h后凝乳酶活力基本保持稳定,复性后凝乳酶相对酶活力最高可提升21.8百分点,能够测到凝乳酶活力(相对酶活力损失93.3%)的热处理时间,从6 min延长到12 min。在酶活力损失相近时,含四氢嘧啶的凝乳酶在较高温度下(68~70℃)保温较短时间(1~5 min),复性所致的相对酶活力提升显著高于在较低温度下(61~65℃)长时间保温(30~180 min)。[结论]酶的热失活处理的温度和时间对酶分子结构的影响效应并不相同,较长时间的热失活处理比短时高温对酶结构的破坏更彻底。     

灭幼脲毒理学研究Ⅸ.灭幼脲对粘虫幼虫表皮蛋白质种类变化的研究

几丁质和蛋白质是昆虫表皮的主要成份,灭幼脲强烈抑制粘虫ＭｙｔｈｉｍｎａｓｅｐａｒａｔａＷａｌｋｅｒ六龄幼虫表皮几丁质的合成和降低表皮各类蛋白质含量,同时还改变了各类表皮蛋白质的比例。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出处理虫表皮新生了一种蛋白谱带,并且某些蛋白谱带生成和消解回吸滞后。     

鸡包涵体肝炎病毒内蒙古毒株的分离与鉴定

本试验利用鸡包涵体肝炎自然病例的肝组织，通过SPF鸡胚连续传代和鸡胚肾细胞培养，分离到一株鸡包涵体肝炎病毒HA株。该病毒的核酸型为DNA、无束膜、对乙醚、氯仿具有抵抗力；且其对酸有抵抗力，对热敏感。电镜观察发现，病毒粒子呈球形，直径约80－100nm。有2、3、4、5、8型的标准阳性血清进行中和试验，证明HA株为血清型2型。回归试验表明HA株具有较强的致病性。     

鸡包涵体肝炎病毒内蒙古毒株的分离与鉴定

本试验利用鸡包涵体肝炎自然病例的肝组织，通过SPF鸡胚连续传代和鸡胚肾细胞培养，分离到一株鸡包涵体肝炎病毒HA株．该病毒株的核酸型为DNA、无束膜、对乙醚、氯仿具有抵抗力；且其对酸有抵抗力，对热敏感。电镜观察发现，病毒粒子呈球形，直径约80～100nm。用2、3、4、5、8型的标准阳性血清迸行中和拭验，证明HA株为血清型2型。回归试验表明HA株具有较强的致病性。     

泡桐灰天蛾颗粒体病毒包涵体蛋白及其DNA的研究

为了充分利用泡桐灰天蛾颗粒体病毒资源，为开展害虫生物防治提供依据，对首次在湖南分离到的泡桐灰天蛾颗粒体病毒进行了研究。采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ垂直板依电泳，测得此病毒包涵体蛋白分子量为３×１０＾４ｕ；用电镜法观察，其ＤＮＡ呈松弛的闭环状双链，平均长度约为２３．９μｍ，分子量为４７×１０＾６ｕ；用ＤＮＡ限制性内切酶分析其分子量为４５．４×１０＾６ｕ。