CDNF-BMSCs移植治疗帕金森病的试验研究

采用Lipo 2000试剂将重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CDNF(大脑多巴胺能神经营养因子)转染至骨髓间充质干细胞(BMSCs);确认构建CDNF-BMSCs成功后,以脑立体定位技术为帕金森病(PD)模型大鼠进行纹状体内CDNF-BMSCs移植治疗;在治疗后不同时间点检测试验动物的旋转行为;利用免疫组织化学、WB技术检测纹状体内CDNF及酪氨酸羟化酶(TH)的表达变化,探讨CDNF-BMSCs移植治疗PD的效果。结果表明:细胞移植治疗2周后,CDNF-BMSCs组大鼠的行为学显著改善,纹状体内CDNF蛋白表达量极显著增加、TH蛋白表达量显著增加;同时,CDNF-BMSCs组动物脑纹状体内CDNF、TH阳性细胞数均随时间逐渐增多。这一研究为基因治疗PD等神经退行性疾病提供了试验依据。     

TNF-α-siRNA联合骨髓间充质干细胞对大鼠类风湿关节炎治疗效果的研究

抑制患者体内肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达可作为治疗类风湿关节炎(RA)的重要途径.以鸡Ⅱ型胶原法诱导的RA模型大鼠为研究对象,探讨TNF-α-siRNA联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗RA的效果及其作用机制.RA大鼠随机分为PBS组(模型对照)、甲氨蝶呤组(阳性药物对照)、BMSCs移植组、TNF-α-...     

犬骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

为了体外高效快捷地分离培养犬(canine)骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),实验分别用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法对犬BMSCs进行分离培养,利用免疫组化和流式细胞术检测获得细胞的表面标志抗体,并用成骨和成脂方向的诱导分化等方法对其进行鉴定。结果表明,全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法都能成功培养出犬BMSCs,但后者相对前者获得的细胞经培养后其原代细胞分布更均匀,原代培养达到传代所需的时间更短,成活率更高;两种方法获得的P3和P8细胞的生长曲线基本保持一致;免疫组化和流式细胞术检测犬BMSCs表达CD105、CD90和CD29,但是不表达CD34和CD31;且能成功诱导为成骨细胞和脂肪细胞。证明采用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法均能够成功分离和培养犬的BMSCs,而密度梯度离心法是一种较全骨髓差速贴壁法更适合犬BMSCs的分离方法。     

羚牛骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

分离鉴定羚牛骨髓间充质干细胞,为开展羚牛细胞治疗与体细胞核移植的深入研究提供有效载体。分离培养来源于羚牛骨髓的间充质干细胞;通过染色体G显带技术进行核型分析;利用流式细胞技术检测细胞表面标记物;通过定向诱导培养探究细胞的分化潜能。结果表明,羚牛骨髓间充质干细胞能够维持正常核型,对间充质干细胞特异性表面标记 CD105、CD73、CD90、CD166、CD44呈阳性,对 CD14(单核细胞和巨噬细胞标记物),CD19(b细胞标记物),CD34(造血干细胞标记物),CD45(泛白细胞标记物)和 HLA-DR均呈阴性,具有成脂、成骨与成软骨多向分化潜能。表明成功分离羚牛骨髓间充质干细胞并对其表面抗原与分化潜能进行鉴定,为羚牛生物多样性保护与内源物种间充质干细胞的应用研究奠定基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究

[摘要〕目的研究在体外培养和纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法〔方法采用改良全骨髓贴壁 方法,分离和纯化3-4周的大鼠BMSCs,镜卜连续观察细胞的形态变化、流式细胞仪鉴定其表面抗原CD45和CD29 均表达情况〔结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24 h后大部分细胞均贴壁〔8-10 d可达800Ic-90%融合,纯化 青传代周期为6-8 d〔流式细胞术鉴定表明C D45阴性,CD29阳性〔结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠 }''J骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法、     

骨髓基质细胞及在神经系统疾病治疗研究中的应用前景

中枢神经系统损伤后的再生仍然是神经科学领域的难题，因此很多研究者开始探索干细胞移植治疗神经系统疾病的可行性，而骨髓基质细胞因自身优势，倍受研究者亲睐，本文重点就骨髓基质细胞及其在神经系统疾病中的应用研究进展进行综述。     

骨髓基质细胞诱导的神经干细胞移植对颞叶癫痫大鼠学习记忆障碍的改善作用

   探讨骨髓基质细胞诱导的神经干细胞移植至海人酸(kanic acid,KA)致痫大鼠海马后对学习记忆障碍的改善作用,从而为干细胞移植治疗癫痫提供理论依据.体外分离大鼠骨髓基质细胞,并在特定条件下培养、诱导分化为神经干细胞.在海马内注射KA建立大鼠癫痫模型,之后把诱导的神经干细胞移植至KA致痫鼠的海马内,用Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力,用PCR方法检测海马内NSE、c-fos和SEZ-6基因表达,采用Western blot技术检测海马内NSE、C-FOS和SEZ-6蛋白表达.结果显示:骨髓基质细胞成功诱导分化为神经干细胞,诱导分化的神经干细胞移植到脑内可明显改善大鼠的学习记忆障碍;移植组大鼠海马内NSE、c-fos和SEZ-6基因表达下调,NSE、C-FOS和SEZ-6蛋白表达亦下调,与阳性对照组及假移植组比较,差异显著(P<0 05).说明骨髓基质细胞诱导的神经干细胞移植至KA致痫大鼠海马后对学习记忆障碍有明显的改善作用,其机制可能与NSE、c-fos、SEZ-6基因和蛋白的表达下调相关.     

多能干细胞来源的肝细胞诱导分化及其应用研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是一类具有多能性和自我更新能力的多能干细胞,这些细胞具有无限增殖能力,并有潜能分化为机体三胚层所有类型的细胞。多能干细胞来源的肝细胞能够作为肝细胞的替代物应用于体外药物筛选和肝脏疾病的治疗。文章对多能干细胞向肝细胞的诱导研究、多能性干细胞来源肝细胞的鉴定方案研究及其在药物筛选和疾病治疗方面的研究进行了综述分析,并对未来的研究方向进行了总结与展望。     

Ca~(2+)信号介导川芎嗪诱导小鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的定向分化

用含2.4 mg.mL-1川芎嗪提取液对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行诱导,探讨川芎嗪体外诱导BMSCs分化为神经元样细胞的作用.应用EGTA(细胞外Ca2+螯合剂)、Nifedipine(L-型Ca2+通道阻断剂)和LY294002(PI3K阻断剂)等Ca2+阻断剂分别作用细胞,RT-PCR和Western blot技术研究Ca2+信号在川芎嗪诱导BMSCs分化为神经细胞过程中的作用.结果表明:川芎嗪作用不同时间的BMSCs均可见Nestin、β-Tubulin Ⅲ、NSE和Nurrl的表达;川芎嗪诱导后的细胞浆内Nestin和NSE蛋白表达呈阳性.EGTA、Nifedipine及LY294002分别阻断细胞外Ca2+、L-型Ca2+通道及PI3K后,NSE和Nurr1基因及NSE蛋白表达较川芎嗪诱导组显著上调.以上结果说明川芎嗪能使BMSCs定向分化为神经元样细胞,细胞内、外Ca2+的减少可促进川芎嗪诱导BMSCs向神经细胞的分化,Ca2+信号在川芎嗪诱导BMSCs向神经细胞定向分化过程中起负调控作用.     

山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及向神经细胞诱导分化的研究

采用体外细胞培养技术将山羊胎儿骨髓中的干细胞从骨髓血中分离并培养扩增;分别用含β-巯基乙醇或当归的培养液诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,免疫组织化学鉴定神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达.结果表明,通过贴壁培养法,可使低丰度的山羊骨髓间充质干细胞在体外实现分离扩增;诱导后的细胞强表达神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶.还建立了一种简单易行的体外分离与培养山羊骨髓间充质干细胞的方法,同时表明山羊骨髓间充质干细胞同样具有分化为神经细胞的潜能,为今后对某些疾病的治疗提供了理想的动物模型.     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存

对分离获得的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行低温冻存研究。用红细胞裂解法体外分离培养BMSCs,采用SABC法进行鉴定;冻存后复苏,台盼蓝染色检测细胞复苏率,观察冻存时间(15d,30d,90d)对各代(P1,P3,P9代)细胞复苏效果的影响;向脂肪细胞诱导分化验证其干细胞多潜能分化特性。结果表明:BMSCs呈长梭形,聚集成旋涡状均匀生长,SABC法鉴定其为BMSCs;冻存前后P1、P3代细胞活力好,增殖速度快;P9代细胞增殖缓慢;冻存时间对P1、P3代细胞复苏率的影响不显著(P0.05),复苏率较高;但是P9代细胞复苏率极低,并且随着冻存时间的延长,细胞复苏率逐渐降低;冻存复苏的细胞向脂肪细胞诱导分化,油红浸染红色。可见:红细胞裂解液法分离获得的BMSCs生长生物学性状稳定;P3代以前冻存增殖和分化特性不受影响,可作为种子细胞用于后续研究。     

骨髓间充质干细胞移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中应用

探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中的应用价值。通过一次性腹腔注射环磷酰胺和白消安建立小鼠卵巢早衰(POF)模型,并随机分为建模组、BMSCs移植组和空白对照组。移植组于建模14 d经尾静脉注射绿色荧光蛋白(GFP)转基因鼠BMSCs悬液(5×10~7个·mL~(-1)),每4 d重复1次,共5次;建模组和空白对照组注射等量生理盐水。观察建模后及BMSCs移植后小鼠的一般情况、血清FSH和E2水平、卵巢组织学变化以及GFP荧光信号在卵巢内的分布。结果发现,建模组小鼠食欲明显减退,活动减少,与空白对照组相比体重显著减轻(P0.05),FSH水平显著增高(P0.05),E2水平显著降低(P0.05),卵巢体积减小,间质纤维化严重,始基卵泡、生长卵泡和成熟卵泡数均显著减少(P0.05)。BMSCs移植后,移植组小鼠体重增加,食欲增强,活动增多;28 d后FSH浓度显著低于建模组(P0.05),E2浓度、始基卵泡、生长卵泡数及成熟卵泡数均显著高于建模组(P0.05),但各项指标仍与空白对照组间存在显著性差异;荧光显微镜下可见绿色荧光信号散在分布于卵泡周围。此结果提示,BMSCs可在小鼠损伤卵巢组织中定位存活,对卵巢组织结构及内分泌功能有修复作用。     

阻断大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化与肿瘤发生相关性研究

【目的】分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件.阻断正常干细胞的分化过程,探讨肿瘤发生机理.【方法】利用贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛联合诱导大鼠BMSCs,使其分化为脂肪细胞.在细胞分化过程中利用3-甲基胆蒽(3-MC)阻断大鼠BMSCs的分化过程.【结果】大鼠BMSCs分化试验显示:诱导30d后经油红O染色,细胞内可见脂肪细胞特有的红色脂滴沉淀,并且随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加,脂滴增大,表明大鼠BMSCs已成功分化为脂肪细胞.大鼠BMSCs分化阻断试验显示:诱导30d后经油红O染色细胞内红色脂滴沉淀明显下降,表明阻断后的细胞具有脂肪细胞的特性,但分化不完全;形态学鉴定表现出:细胞接触抑制消失,细胞核异常,微核畸变率高,核型异常,表明阻断后的干细胞发生恶性转变.【结论】通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛的联合作用,诱导BMSCs成功向脂肪细胞分化.在BMSCs向脂肪细胞分化的过程中加入阻断剂3-MC,阻断其分化过程,表明干细胞分化过程受到阻断,细胞停止在分化的中间阶段,有转化成肿瘤细胞的趋势.     

通过可调控Lhx2的表达制备小鼠造血干细胞系

【目的】研究一种永生化小鼠造血干细胞系的制备方法。【方法】通过添加Doxycycline来诱导Lhx2基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达,获得造血干细胞系。而在这些永生化的造血干细胞移植前,撤销Doxycycline,终止Lhx2基因的表达。【结果】永生化的造血干细胞系和原代造血干细胞一样,能在受体小鼠骨髓中增殖,并在外周分化为T细胞、B细胞和髓系细胞。Lhx2的异位表达可能会改变这些细胞以降低其在体内的适应性。【结论】本研究通过条件性表达Lhx2获得的永生化造血干细胞系与成年小鼠骨髓中的原代造血干细胞相比,具有相似的表面标志物,从而证明Lineage~-Sca-1~+c-kit~+,永生化的造血干细胞系极易扩增,可以获得大量均一的细胞群体。     

乳腺炎模型大鼠注射BMSCs和抗生素后血清中急性期蛋白水平变化的研究

[目的]探讨乳房基底部移植大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)对实验性乳腺炎大鼠血清中急性期蛋白水平变化的影响.[方法]通过乳头管灌注内毒素的方法建立实验性大鼠乳腺炎模型,并将70只SD雌性大鼠中的60只随机分为3组:对照组(乳房基底部注射生理盐水)、抗生素组(乳房基底部注射抗生素,5 000万单位/侧)、移植BMSCs组[乳房基底部移植BMSCs50 μL(1×106个)],每组20只.试验0和1d各屠宰5只(三组共用),之后每组于试验2、5、7和9d分别屠宰5只,心脏采血,制备血清,检测血清中结合珠蛋白(Hp)、血清淀粉样蛋白-A(SAA)、C-反应蛋白(CRP)水平.[结果]抗生素组血清中SAA、Hp、CRP水平于2、5、7d时均显著低于对照组(P＜0.05),移植BMSC组Hp水平于2、5d时、SAA水平于2、5、7d时、CRP水平于5、9d时均显著低于对照组(P＜0.05).[结论]BMSC和抗生素均能降低乳腺炎大鼠血清中急性期蛋白水平.     

骨髓间充质干细胞治疗缺血性心脏病的应用及其机制的研究进展

BMSCs是近年来细胞治疗的理想种子细胞,研究发现对治疗多种心脏疾病均有较好的疗效。本文从其生物学特性,其对缺血性心脏病体内、外的研究进展及其治疗缺血性心脏病的机制几方面对BMSCs在缺血性心脏病治疗中的应用做一阐述。     

抗淀粉样蛋白寡聚体单链抗体融合蛋白在真核细胞中表达的初步研究

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种由脑内淀粉样蛋白(A)聚集引起的,以老年人记忆和认知功能丧失为临床表征的神经退行性疾病。研究表明,A寡聚体是AD发生发展的主要因素。应用自行筛选出的能够特异识别淀粉样蛋白寡聚体的单链抗体W20基因,构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达载体pSNAV2.0-W20-EGFP,并应用流式细胞分选、蛋白免疫印迹以及荧光显微镜等技术对该单链抗体融合蛋白在真核细胞中的表达进行了初步研究,为针对AD的抗体基因治疗奠定了基础。     

CALR基因:慢性骨髓增殖性肿瘤(CMPN)新分子标记物

慢性骨髓增殖性肿瘤(CMPN)是骨髓中一系或多系髓系细胞增殖的克隆性造血干细胞疾病。近年来,多个分子标志物如JAK2、MPL基因突变等相继被发现,但仍有30%~45%的携有野生型JAK2/MPL的原发性血小板增多症(ET)或原发性骨髓纤维化(PMF)患者缺乏特异性分子标记物,诊断存在困难。近期新发现的钙网蛋白基因(CALR)突变将能填补这一空白,有望成为诊断骨髓增殖性肿瘤又一种新的分子标记物,对于理解CMPN的分子发病机制具有重要意义,对这类疾病进行诊断和治疗具有重要意义。     

人类胚胎干细胞研究述评

对人类胚胎干细胞(hESCs)的来源、培养方法、建系条件、生物学特性和鉴定方法、遗传操作及其需解决的问题进行了讨论。提出目前研究的重点在于揭示维持ES细胞多能性和自我更新的机理,进一步优化人类和其他哺乳动物类ES细胞的分离、培养、建系方法,探讨其定向分化机理,建立胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)的大规模快速扩增技术;完善hESCs向重要功能细胞(生殖细胞)分化的体系;单细胞比对分析ESCs、畸胎瘤细胞(ECSs)、EGCs、类胚体(EBs)、各级生殖细胞和成体细胞的基因及蛋白表达图谱,以探求生殖细胞、成体细胞、ESCs、ECSs、EGCs的本质区别,积极开展将ES细胞用于治疗人类疾病模型的研究。     

胰腺干细胞的分子标志及其获得途径

胰岛移植是目前治疗I型糖尿病的最佳方法,但供源的匮乏限制了此方法的应用。寻找胰岛细胞新来源已成为糖尿病研究的热点。胰腺干细胞的研究为糖尿病的细胞移植治疗展示了良好的应用前景。本文就胰腺干细胞的分子特征及其获得途径的研究进行综述。