伪狂犬病病毒Fa 株gI和gp63基因缺失株的构建

用限制性核酸内切酶NcoI消化含有伪狂犬病病毒(PRV)Fa株BamHI-7片段的质粒PBB7,以低融点琼脂糖回收目的片段,经连接并转化 E.coli DH5a,获得缺失了gI和部分gp63基因的重组质粒PPB7-1.将PRVFa与PPB7-1DNA共同转染PK15单层细胞,待出现50%以上细胞病变时收获病毒,并以蚀斑法得到纯化重组病毒株,命名为PFDI/D63.小鼠试验证实,缺失株对小鼠具有一定的免疫原性.     

猪伪狂犬病毒gE基因缺失毒株的构建及其免疫原性的研究

通过CRISPER/Cas9编辑技术编辑实验室分离得到的PRV-SX株的gE基因,并利用蚀斑纯化等方法得到gE基因缺失的突变株。通过T7E1核酸内切酶及测序来鉴定gE基因的缺失,并对gE基因缺失毒株的免疫效果进行了研究。结果表明:应用CRISPER/Cas9编辑技术成功得到了gE基因缺失毒株,用这一毒株制备疫苗免疫仔猪,免疫后0 d、14 d、28 d、42 d、56 d PRV gE抗体均为阴性;PRV gB抗体呈阳性,在42 d时达高峰。     

伪狂犬病毒粤A株gE基因真核表达质粒的构建

根据伪狂犬病毒(PRV)NLA-3和Rice株的gE基因序列，设计了1对含有起始密码子和HindⅢ、BarnHI酶切位点的引物，以PRV粤A毒株（PRV-YA)基因组为模板，利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得gE基因片段，将这一片段克隆至PMDl8-T载体中，获得重组质粒PMID18-gE；用HindⅢ和BarnHI酶切该重组质粒，回收得到含有以上2个酶切位点粘端的gE基因，将此基因片段克隆至相同酶切、回收后的pcDNA3．1( )真核表达载体中，获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-gE，经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。     

基于CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建TK、gE和gI基因缺失的伪狂犬病病毒

为构建TK、gE和gI基因缺失的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV),采用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术,对从湖北某猪场送检的病料中分离到的PRV HB2017株进行基因编辑,并利用蚀斑纯化等方法获取基因缺失株.随后,采用PCR、基因测序、间接免疫荧光试验、生长曲线测定及安全性和效力试...     

猪伪狂犬病毒湖北株gE基因的克隆与序列分析

[目的]通过对从湖北省某猪场分离获得的伪狂犬病毒的gE基因克隆和测序,分析其遗传变化规律。[方法]参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)gE基因的序列设计1对引物,对PRV湖北株gE基因进行PCR扩增和序列分析,PCR产物克隆到pMD 18-T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株进行同源性分析和比较。[结果]与标准参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%~98.0%,进化树分析表明,PRVHBXS2014株与河南焦作株EU561349-China同属于一个分支,亲缘关系较近,但存在个别位点的基因突变。[结论]为有效防控该病提供参考。     

猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究

【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV AH进行同源重组,利用EGFP为筛选标记,获得携带EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–/EGFP~+,以此毒株与pMD-LA-RA进行第2次同源重组,筛选去除EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–,并通过生长曲线、易感细胞连续传代和动物免疫评价其增殖能力、遗传稳定性及免疫原性。【结果】通过2次同源重组,结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,成功获得了PRV AH gE~–/gI~–,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株g E和g I基因被成功缺失,且不携带EGFP标记基因。生物学特性研究结果表明,该毒株增殖能力与亲本毒株相当,遗传稳定性及免疫原性良好。【结论】采用同源重组技术成功构建了免疫原性良好的猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI基因缺失突变株,为研制针对流行毒株的基因缺失疫苗奠定了一定的基础。     

猪伪狂犬病毒贵州分离株gE基因的克隆及遗传信息分析

为了解贵州地区猪伪狂犬病毒的分子流行现状,本研究提取实验室分离并保存的PRV GZJS2017株病毒核酸作为PCR扩增模板,并对其进行TA克隆、序列测定和用生物学软件进行遗传信息分析。结果表明:本次分离得到的GZJS2017株gE基因所测长度1740 bp,GC含量为73.97%,通过系统进化树分析结果显示PRV不同地域毒株之间同源率达98.8%~99.9%,说明该毒株gE基因具有高度的保守性。本研究可为今后深入开展PRV gE基因的功能研究提供一些依据。     

伪狂犬病毒PK基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK/gI缺失疫苗株为亲本株,提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段。将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA。用限制性内切酶SacⅠ NdeⅠ缺失质粒P8-AA中PK基因的2 218 bp片段,在此缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-CI-VP1中含绿色荧光蛋白基因和VP1基因的完整表达盒,构建出可用于同源重组的转移载体P8-EGFP-VP1。     

猪伪狂犬病毒YZ株gE全基因的克隆与序列分析

为了解猪伪狂犬病毒(PRV)g E基因的遗传变异特性,根据Gen Bank已发表的PRV g E全基因序列,设计并合成1对特异性引物,对PRV YZ株进行了g E全基因的扩增、克隆及测序,并与其他参考毒株g E基因进行比较序列分析。测序结果表明,YZ株g E全基因序列由1 862bp组成,与Gen Bank已发表的13株PRV g E参考株序列同源性介于97.9%~99.9%。进化树分析表明,YZ株与目前国内流行的毒株在同一进化分支内,与国外分离株有一定差异。     

山西猪伪狂犬病毒gE基因主要抗原区的遗传变异分析

根据Gen Bank中收录的PRV Becker株的gE基因序列,设计了合成1对引物,对山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE部分基因进行了PCR扩增,并进行克隆与序列分析。经测序,山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE部分基因核苷酸序列长度为997 bp,编码322个氨基酸。测序后对山西流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列和推导出的氨基酸序列与18株PRV参考株进行了遗传变异分析,结果显示,山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列与18株PRV参考株之间同源性为97.8%~100%,其中与YY株(湖南)、SC-1-2015株(四川)、HNXX2012株(湖北)、HN-DZ株(广东)及DL14-08株(长春)同源性最高,均为100%,与75V19株(比利时)同源性最低,为97.8%。山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列推导的氨基酸序列与18株PRV参考株之间同源性为96.1%~100%,其中与YY株(湖南)、SC-1-2015株(四川)、HNXX2012株(湖北)、HN-DZ株(广东)及DL14-08株(长春)同源性最高,均为100%,与Rice(美国)同源性最低,为96.1%。山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因序列的遗传进化分析表明,山西PRV流行株属于2012年以来分离的PRV变异株群,与YY株和HNXX2012株亲缘关系较近,与欧洲和美洲分离株亲缘关系较远。     

伪狂犬病毒TK基因缺失通用转移载体的构建及初步应用

以伪狂犬病毒为载体表达其他病原体抗原蛋白是伪狂犬病疫苗研究的一个重要方向。根据已发表的伪狂犬病毒（PRV）Ra株TK基因序列设计2对引物,用PCR方法得到同源左右臂,克隆入PUC19载体中。利用平末端连接的方法将绿色荧光蛋白（EGFP）的基因表达盒插入到缺失位点,并在下游引入1个多克隆位点,构建缺失通用转移载体PUC19TK-EGFP。用脂质体转染试剂盒将PUC19TK-EGFP和PRV-Ra株的基因组共转染BHK细胞,以EGFP为标记基因,用噬斑法得到纯化的重组病毒,命名为TK/EGFP,为研制以伪狂犬病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株gE基因原核表达质粒的构建

为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。     

含GFP-Lac Z基因的伪狂犬病病毒上海株缺失株的构建

在伪狂犬病病毒(PRV)上海株gI和gE基因克隆鉴定的基础上，用BamHⅠ BstpⅠ去掉gE基因的5′端363bp，在缺失位置插入绿色荧光蛋白(GFP)和Lac Z基因，构建含双报告基因的PRV-SH转移载体pgEI-GFPZ。将psEI-GFPZ转染PRV-SH的BHK-21细胞，待出现80％病变后收获病毒，并以蚀斑法得到纯化的含Lac Z和GFP两种筛选标记的缺失了gE／gI的重组病毒株。     

伪狂犬病毒Fa株gB、gC、gD基因的克隆与序列分析

对猪伪狂犬病病毒闽A株(Fa株)gB、gC、gD基因进行了克隆和序列测定,结果表明:gB、gC、gD基因序列全长分别为2 745 bp、1464 bp、1 215 bp,编码914、487、404个氨基酸残基组成的多肽。序列分析结果显示:Fa株与其他毒株gB、gC、gD基因核苷酸序列的同源性为94.9%~99.9%,氨基酸序列的同源性为91.4%~99.9%。不同PRV毒株gB、gC、gD基因在核苷酸和氨基酸水平上高度保守。基于gB、gC、gD基因的进化树分析表明,中国分离毒株与韩国分离毒株可归为一个进化分支,而日本分离株与欧美分离株归为另一个分支。在前一个分支里,闽A株与鄂A株的亲缘关系特别近,3个基因的同源率均在99.5%以上。在gB蛋白氨基酸序列全长上中国分离株(Ea株、Fa株)比欧美分离株多了1个氨基酸,氨基酸残基的突变主要集中在第50~100氨基酸。在gC基因序列第186~211 bp,Ea株、Fa株比欧美分离株多插入了21个碱基。在gD蛋白氨基酸序列全长上,Ea株、Fa株比其他分离株多了2~6个氨基酸。在gD基因序列第803~837 bp,Fa株核苷酸AGGCCC串联重复最多,达到7个。     

猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达及其单克隆抗体的筛选

为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株。通过诱导表达获得gE分泌蛋白,并利用Ni柱进行纯化,应用Western blot、Dot blot、ELISA方法对纯化蛋白进行活性鉴定。同时将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体,并对单克隆抗体进行了反应性测定、效价测定及亚型鉴定。结果显示,PRV gE蛋白在毕赤酵母中成功表达,并获得了纯化蛋白,纯度达90%以上,且具有良好的生物学活性,与PRV阳性血清反应性良好;筛选到4株敏感性强、特异性良好的gE单克隆抗体,均可同时特异识别PRV gE蛋白及病毒,分别命名为2F10、4C10、9E1、10C3。综上,用酵母系统成功表达了PRV gE蛋白,并筛选到4株针对PRV gE蛋白的单克隆抗体。     

狂犬病毒CVS株G基因和N基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过引入内部核糖体进入位点序列,构建狂犬病毒G基因和N基因共表达的腺病毒载体。通过RT-PCR方法扩增得到RVG基因、N基因。N基因先亚克隆入pIRES质粒;G基因经Kpn I和Mlu I,pIRES-N质粒经Mlu I、Not I双酶切,回收目的基因后与经Kpn I和Not I双酶切处理的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒,RT-PCR 法检测狂犬病毒糖蛋白和核蛋白基因片段。该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR 法可检测到糖蛋白和核蛋白基因片段。试验成功构建了G和N双基因共表达重组腺病毒载体,为狂犬病活载体疫苗的研制提供了依据。     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

新型伪狂现病毒基因缺失株的构建

以伪狂犬病病毒Ｆａ株为起我建;的ｐｐ６３ＬａｃＺ转移载体质粒与ＰＲＶ Ｆａ ＤＡ经磷酸钙转染,在ＭＤＢＫ细胞内同源重组获得ＰＲＶ Ｆａ ｇＥ／ｇｉ＾－／ＬａｃＺ基因缺失株。以ＰＤＴＫ３－６,５－６ＴＫ缺失质粒与上述基因缺失株在ＴＫ＾－１４３细胞内同源重复且,获得ＰＲＶ－ＳＡ２１５等三基因缺失株。经核酸杂交证实构建是成功的。生物学特性观察显示,该基因缺失株对多种动物安全,具有良好的免疫原性,有望成为     

猪伪狂犬病毒C株的分离鉴定

在流行病学调查中分离到的1株伪狂犬病毒,命名为猪伪狂犬病毒C株,并对其进行鉴定、纯化。在gE和gI基因段上设计特异性引物进行PCR检测,闽A株在5 000 bp处出现目的条带,该毒株在1 500 bp附近出现目的条带,对目的条带测序,扩增产物大小为1 538 bp,在第989—4 468位基因缺失,缺失片段大小为3 570 bp,该缺失片段包含了伪狂犬病病毒的主要毒力基因(gE基因),除此缺失片段外,分别在第873、4 665、4 666、4 950位发生了碱基突变,同猪伪狂犬病病毒Bartha K61同源性为95.0%—96.0%,与PRV Bartha K61不是同一个毒株。用该毒株对部分省市分离到的伪狂犬毒株和标准毒株闽A株进行中和试验,中和指数为708—6 761,该毒株可完全中和临床分离的伪狂犬病毒株,故可用作候选疫苗毒株。