双氢睾酮对小鼠卵泡颗粒细胞增殖与抗苗勒管激素表达的影响

【目的】探讨双氢睾酮(DHT)对小鼠颗粒细胞增殖与抗苗勒管激素(AMH)表达的影响。【方法】给3周龄的昆明小鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG,10 IU/只)以获取颗粒细胞,颗粒细胞传代后48 h HE染色鉴定形态,绘制颗粒细胞的生长曲线,免疫荧光法鉴定促卵泡素受体(FSHR)的表达。当第2代颗粒细胞汇合度达到50%时,先用无血清的DMEM/F12培养基饥饿处理12 h,然后在培养基中添加不同浓度的DHT (0、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5 mol/L),培养48 h后检测颗粒细胞增殖情况,实时荧光定量PCR法及ELISA法分别测定AMH基因及蛋白的表达。在颗粒细胞培养液中分别添加10^-6 mol/L Flutamide (雄激素受体(AR)特异性抑制剂)、10^-7 mol/L DHT、10^-7 mol/L DHT+10^-6 mol/L Flutamide、10^-5 mol/L DHT、10^-5mol/L DHT+10^-8 mol/L 11-ketodihydrotestosterone (AR特异性激动剂),分别记为F、D7、DF、D5、DK组,以不添加药物为对照组。培养48 h后,检测各组颗粒细胞增殖及AMH蛋白含量。【结果】体外培养的小鼠颗粒细胞呈梭形或铺路石状,生长曲线呈S形,细胞普遍表达FSHR;与0 mol/L DHT组相比,10^-8、10^-7 mol/L DHT组细胞增殖分别显著和极显著增加(P＜0.05;P＜0.01),10^-5 mol/L DHT组细胞增殖显著降低(P＜0.05);10^-7 mol/L DHT组AMH基因的相对表达量和AMH蛋白含量均极显著增加(P＜0.01)。与D7组相比,DF组颗粒细胞增殖和AMH蛋白含量均极显著降低(P＜0.01);与D5组相比,DK组颗粒细胞增殖和AMH蛋白含量均极显著升高(P＜0.01)。【结论】10^-7 mol/L DHT能够显著促进颗粒细胞增殖和AMH表达,而10^-5 mol/L显著降低了颗粒细胞增殖以及AMH表达,且AR介导了DHT调控颗粒细胞增殖和AMH表达。     

不同浓度神经肽P物质刺激对内蒙古白绒山羊皮肤干细胞BMP2、BMP4基因表达的影响

本研究旨在探讨不同浓度的神经肽P物质(SP)刺激对内蒙古白绒山羊皮肤干细胞BMP2、BMP4基因表达的影响。本研究分别采用0(对照组)、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8、1×10^-9 mol/L 5个浓度梯度的SP对内蒙古白绒山羊皮肤干细胞进行刺激处理,并分别于第0、7、14及21天采用实时荧光定量PCR方法鉴定BMP2和BMP4基因的表达量。结果显示,1×10^-6和1×10^-8 mol/L的SP促进BMP2、BMP4的表达;在7和14 d时,SP 1×10^-8 mol/L组BMP2的表达量显著高于SP 1×10^-6 mol/L组(P<0.05),SP 1×10^-6 mol/L组BMP4的表达量与SP 1×10^-8 mol/L组差异不显著(P>0.05);在21 d时,SP 1×10^-8 mol/L、SP 1×10^-6 mol/L组BMP2、BMP4的表达量都明显降低,其中SP 1×10^-8 mol/L组BMP2的表达量显著高于1×10^-6 mol/L组(P<0.05),SP 1×10^-6 mol/L组BMP4的表达量与SP 1×10^-8 mol/L组差异不显著(P>0.05)。结果表明,SP 1×10^-6和1×10^-8 mol/L不仅对内蒙古白绒山羊皮肤干细胞BMP2、BMP4基因的表达量有影响,而且为皮肤干细胞的定向分化提供理论基础。     

添加褪黑素对牛精液品质的影响

为探讨褪黑素(melatonin,MLT)在牛精液保存中的抗氧化作用,本研究利用目测法、低渗膨胀法和考马斯亮兰染色法分析了不同MLT浓度(0、10^-3、10^-4和10^-5 mol/L)和不同孵育时间(1、4和8 h)对精子活力、质膜和顶体完整性的影响。结果发现,与对照组相比,在稀释液中分别添加10^-3和10^-4 mol/L MLT均可显著提高精子活力、质膜完整率和顶体完整率(P＜0.05),且10^-3 mol/L MLT添加效果最佳;MLT(10^-3 mol/L)组在27 ℃孵育1、4 h后,其精子的活力、质膜完整率和顶体完整率均显著高于对照组(P＜0.05)。因此,添加10^-3 mol/L MLT可明显改善牛精液品质,提高牛精液的保存时间和保存质量。     

三种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒和两种核酸提取方法的比对

为评价不同荧光PCR检测试剂盒对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的检测效果,以及不同核酸提取方法对ASFV的提取差异,选取ASFV B646L基因标准物质作为模板参照,通过荧光PCR检测对标准曲线、最低检出限(LOD)、特异性、检测时间等进行比较,分析3个厂家商品化ASFV荧光PCR检测试剂盒(A、B、C)的综合性能;选取磁珠法和柱式法两种核酸提取方式,对标准物质核酸提取后进行ASFV荧光PCR扩增,以Ct值大小评价试剂的提取效果。结果显示：3种ASFV荧光PCR试剂盒决定系数(R²)分别为0.985、0.996、0.985,且特异性较好;3种ASFV荧光PCR试剂盒LOD介于10^-1～10^-2 copies/μL,A试剂盒反应循环数最多且反应时间最长(105 min),LOD为10^-2 copies/μL。全自动核酸提取工作站与手工核酸提取Ct值无统计学差异(P> 0.1),批内变异系数(CV)在1.5%以内。结果表明：3种荧光PCR检测试剂盒的综...     

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10⁶ ～1.0×10¹ copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10¹ copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^-2 pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。     

双氢睾酮通过调控孕酮、雌二醇和细胞凋亡参与绵羊子宫功能

旨在探究双氢睾酮（dihydrotestosterone,DHT）是否通过调节孕酮（progesterone,P₄）、雌二醇（oestrogen,E₂）和细胞凋亡参与影响绵羊子宫功能,以揭示其在绵羊生殖生理中的潜在作用。本试验以1.5岁左右的雌性小尾寒羊为试验动物,检测卵泡期、黄体期和妊娠期子宫中DHT合成酶和雄激素受体（androgen receptor,AR）的表达变化。随后,体外培养绵羊子宫内膜上皮细胞,并用DHT （10^-10~10^-7 mol·L^-1）和AR拮抗剂氟他胺（Flu,10^-8 mol·L^-1）处理（n=3）。通过酶联免疫吸附试验、细胞免疫荧光、蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR检测P₄和E₂水平、合成酶和受体表达。此外,还检测经DHT和Flu处理后,绵羊子宫内膜上皮细胞中凋亡因子Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax）、B细胞淋巴瘤蛋白2（B cell lymphoma protein 2,Bcl-2）、半胱天冬酶3（caspase 3,CASP3）和活化半胱天冬酶3（active-caspase 3,Act-CASP3）的表达变化。结果表明,绵羊子宫不同时期DHT的合成和AR的表达存在差异,妊娠期子宫DHT合成及AR表达显著低于卵泡期和黄体期（P<0.05）。10^-10~10^-7 mol·L^-1DHT处理后,P₄合成酶表达显著上调（P<0.05）,在10^-8~10^-7 mol·L^-1 DHT时P₄合成显著增加（P<0.05）,在10^-10~10^-8 mol·L^-1 DHT时孕酮受体蛋白表达显著增加（P<0.05）,但10^-7mol·L^-1 DHT时孕酮受体蛋白表达显著下降（P<0.05）;在10^-8~10^-7 mol·L^-1 DHT时E₂相关合成酶显著减少,并且E₂水平显著下降（P<0.05）,在10^-9和10^-7 mol L^-1 DHT时E₂受体ERα蛋白显著下调（P<0.05）,在10^-10~10^-7 mol·L^-1 DHT时ERβ和GPER显著增加（P<0.05）。经Flu处理后部分解除DHT对P₄和E₂的调控。此外,10^-10~10^-7 mol·L^-1 DHT显著促进子宫内膜上皮细胞凋亡（P<0.05）。本研究证实DHT至少部分通过AR调节P₄和E₂合成及受体表达,影响细胞凋亡,参与调节子宫功能,这为进一步阐明雄激素参与调节子宫功能提供了新的基础和相关数据。     

猪δ冠状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),根据PDCoVM基因保守区域设计引物和探针,建立了一种PDCoV实时荧光RT-PCR检测方法,并评价了该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,该方法的拷贝数对数值与Ct值在1.3×10³～1.3×10⁷ copies/μL拷贝数浓度范围内呈现良好的线性关系,R²=0.994;最低检出限为13 copies/μL,且无非特异性扩增;批内和批间重复性试验变异系数(CV)为0.24%～2.15%,均小于3%。利用该方法和普通RT-PCR对42份临床样品同时进行检测,发现本方法比普通RT-PCR灵敏性更高,二者符合率为95.2%。以上结果表明,本试验建立的实时荧光RT-PCR方法灵敏、特异、可靠,可用于PDCoV的临床检测和流行病学调查。     

阿拉善双峰驼ENaCα亚基基因克隆及激素对肾皮质细胞中该基因表达的影响

为探究阿拉善双峰驼上皮细胞钠通道的作用特点,试验采用深圳华大公司提供的ENaCα亚基基因片段序列设计PCR引物,提取阿拉善双峰驼肾皮质总RNA,反转录合成cDNA,PCR扩增获得双峰驼ENaCα亚基基因,构建克隆质粒pMD19-T-ENaCα,对重组质粒进行双酶切和测序分析;采集双峰驼肾皮质部分,细胞体外培养到P3代后,加入不同浓度的醛固酮(aldosterone)和血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ),实时荧光定量PCR技术检测细胞中ENaCα亚基基因的表达情况,以确定ENaCα对两种激素浓度变化的敏感性。结果显示,PCR扩增得到2.2kb的特异性条带,SmaⅠ和PstⅠ双酶切得到2.2和2.7kb的条带,表明重组质粒pMD19-T-ENaCα构建成功。实时荧光定量PCR结果显示,1×10^-9 mol/L醛固酮和血管紧张素Ⅱ处理的双峰驼肾皮质细胞的ENaCα表达量显著高于对照组(P<0.05);1×10^-6、1×10^-7和1×10^-8 mol/L醛固酮和血管紧张素Ⅱ表达量显著低于对照组(P<0.05)。本研究结果为揭示双峰驼水盐代谢的生理机制提供了试验依据。     

阿拉善双峰驼ENaCα亚基基因克隆及激素对肾皮质细胞中该基因表达的影响

为探究阿拉善双峰驼上皮细胞钠通道的作用特点，试验采用深圳华大公司提供的ENaCα亚基基因片段序列设计PCR引物，提取阿拉善双峰驼肾皮质总RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增获得双峰驼ENaCα亚基基因，构建克隆质粒pMD19-T-ENaCα，对重组质粒进行双酶切和测序分析；采集双峰驼肾皮质部分，细胞体外培养到P3代后，加入不同浓度的醛固酮（aldosterone）和血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ），实时荧光定量PCR技术检测细胞中ENaCα亚基基因的表达情况，以确定ENaCα对两种激素浓度变化的敏感性。结果显示，PCR扩增得到2.2 kb的特异性条带，SmaⅠ和PstⅠ双酶切得到2.2和2.7 kb的条带，表明重组质粒pMD19-T-ENaCα构建成功。实时荧光定量PCR结果显示，1×10^-9 mol/L醛固酮和血管紧张素Ⅱ处理的双峰驼肾皮质细胞的ENaCα表达量显著高于对照组（P<0.05）；1×10^-6、1×10^-7和1×10^-8 mol/L醛固酮和血管紧张素Ⅱ表达量显著低于对照组（P<0.05）。本研究结果为揭示双峰驼水盐代谢的生理机制提供了试验依据。     

茶树油对三种常见致病菌的体外抑菌活性研究

为了确定茶树油的体外抑菌敏感度和最低体外抑菌浓度,本试验抑菌剂选择茶树油,供试菌选择沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,进行体外抑菌试验,并测定茶树油原液的抑菌圈以及不同稀释度的茶树油和1.5×10⁸ cfu/ml菌悬液混合培养后在600 nm波长处的光密度值。试验结果表明,茶树油在3种细菌中对金黄色葡萄球菌最为敏感,对沙门氏菌和大肠杆菌次之,对3种菌的抑制培养最大突变区间分别为金黄色葡萄球菌2^-3×10^-1～2^-2×10^-1、沙门氏菌2^-4×10^-1～2^-3×10^-1和大肠杆菌2^-7×10^-1～2^-6×10^-1。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究为了建立一套检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的23株编码ASFV结构蛋白p72的基因序列,设计引物和探针,优化退火温度、Mg^2＋浓度和引物、探针浓度,生成标准曲线,进行重复性、敏感性、特异性试验,并检测样品。结果显示,优化的退火温度为60 ℃,Mg^2＋终浓度为4 mmol/L,引物、探针终浓度分别为0.8、0.3 μmol/L。重复性试验变异系数均小于1.3%,敏感性试验最低能够检测到10拷贝/μL的质粒,以其他5种猪病病毒和ASFV质粒为模板进行特异性试验,只有ASFV质粒出现扩增曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法是快速、灵敏、特异的检测ASFV的方法。     

牛结节性皮肤病病毒荧光定量PCR方法的建立与应用

为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法,本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明,建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10¹ ～3.67×10⁷ copies/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9905;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为3.67×10 copies/μL;该方法特异性良好,与山羊痘病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒等病毒不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内和批间的变异系数均介于0.133%～1.81%。该方法,临床样品的检测符合率达90%。本试验所建立的LSDV荧光定量PCR方法为临床诊断牛结节性皮肤病提供了一种快速、灵敏的检测方法,为LSDV流行病学调查和监测提供了技术支持。     

微滴式数字PCR定量检测禽偏肺病毒方法的建立

为建立禽偏肺病毒(aMPV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法，本研究以aMPV F基因为靶基因，根据其保守区域设计特异性引物和探针，通过各反应条件的优化，初步建立检测aMPV的dd PCR方法。反应条件优化结果显示，最佳引物终浓度1μmol/μL，探针终浓度0.5μmol/μL，退火温度56℃。绘制的标准曲线显示，重组质粒标准品稀释倍数的对数与相应质粒检出拷贝数的对数呈良好的线性关系(R²=0.999 8)。采用该方法同时检测aMPV、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒，结果显示，仅aMPV检测为阳性，其他病原均为阴性。特异性较强。将p MD18-aMPV重组质粒标准品10倍倍比稀释(105～10⁹,4.3×10³拷贝/μL～4.3×10^-1拷贝/μL)后作为模板，采用该方法检测，结果显示该方法对重组质粒标准品的检测限为4.3拷贝/μL，比荧光定量PCR (qPCR)检测限(43拷贝/μL)敏感。对3个稀释度质粒标准品...     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为检测牛传染性鼻气管炎病毒,通过设计针对gB基因的特异性引物扩增gB基因,构建阳性重组质粒。经过优化建立了牛传染性鼻气管炎病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在5.474×10⁴～5.474×10⁹拷贝/μL时线性关系良好,线性相关系数R²=0.999 3。该方法最低检测限为5.747×10²拷贝/μL;可以特异性检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应。病毒滴度与拷贝数的线性关系良好,线性相关系数R²=0.985 4。该方法为牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测提供了技术支持。     

雌激素对奶牛输卵管组织COX-1和COX-2表达的影响

试验旨在阐明雌激素(E₂)对体外培养的奶牛输卵管组织中环氧合酶-1(cyclooxygenase-1,COX-1)与环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因表达的影响。分离培养奶牛输卵管组织,用不同浓度的E₂作用于奶牛输卵管组织,采用实时荧光定量PCR与Western blotting检测COX-1与COX-2 mRNA和蛋白的表达量。结果表明,E₂作用浓度为10^-11 mol/L时奶牛输卵管组织中的COX-1与COX-2 mRNA相对表达量达到高峰;E₂作用时间为8 h时COX-1 mRNA的相对表达量达到高峰,E₂作用时间为2 h时COX-2 mRNA的相对表达量达到高峰;浓度为10^-11 mol/L的E₂作用不同时间后,COX-1蛋白的相对表达量在8~48 h显著升高;没有检测到COX-2蛋白的表达。     

猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光定量PCR方法的建立与应用

为了建立能够猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)和非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)双重荧光定量PCR方法,试验比对了CSFV与ASFV的基因组序列,针对CSFV 5′-UTR和ASFV B646L保守靶序列,分别设计2条特异性引物及1条TaqMan探针,通过优化扩增体系和程序,建立可同时检测CSFV和ASFV的双重荧光定量PCR方法,并建立该方法的标准曲线,同时用敏感性试验、特异性试验和重复性试验对该方法进行评价,最后检验该方法的应用效果。结果表明：CSFV和ASFV标准曲线的相关系数(R²)分别为0.999和1,线性关系良好;CSFV与ASFV的最低检测浓度分别为1.3×10⁰ copies/μL和2.4×10⁰ copies/μL;与其他常见猪只病原检测无交叉反应;批间与批内变异系数均小于2%,稳定性良好。试验建立的方法对44份临床样本的检测结果与《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 27540—2011)和《非洲猪...     

睾酮对新生期大鼠支持细胞和精原细胞Adamts16表达的影响

[目的]研究睾酮对新生期大鼠支持细胞和精原细胞中血小板反应蛋白解整合素金属肽酶16(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs 16,Adamts16)基因表达的影响,以及Adamts16基因与大鼠隐睾的关系。[方法]利用RT-qPCR技术检测不同浓度睾酮(10^-6、10^-7、10^-8、10^-9mol/L)培养大鼠支持细胞和精原细胞6、12、24 h后Adamts16基因的mRNA相对表达量,确定睾酮诱导支持细胞和精原细胞Adamts16基因mRNA表达的最佳剂量和最佳时间。应用HE染色法观察出生2、4、8 d野生型和Adamts16基因敲除型大鼠的睾丸位置。[结果]用10^-6mol/L睾酮诱导大鼠支持细胞6 h时Adamts16基因的mRNA相对表达量最高。用10^-7mol/L睾酮诱导大鼠精原细胞24 h时Adamts16基因mRNA相对表达量最高。与野生型大鼠相比,Adamt...     

牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

牛纽布病毒(bovine nebovirus, BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原，为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法，本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针，并通过优化反应体系，成功建立了BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并对临床样品进行检测。结果表示，该方法最佳上下游引物浓度均为500 nmol/L,探针浓度为400 nmol/L,在1×10⁸～1×10¹拷贝/μL之间呈现良好的线性关系，线性相关系数R²=0.996,扩增效率为105.9%;该方法特异性较强，在多个犊牛腹泻相关病原中，只检测出BNeV;敏感性较高，对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10¹拷贝/μL,而普通PCR对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10³拷贝/μL;重复性较好，组内变异系数和组间变异系数均小于3%;对2021年3-5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BNeV的检出率为35.1%,...     

牛冠状病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种敏感、特异的牛冠状病毒(BCoV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,试验利用GenBank中BCoV参考毒株N基因序列,设计引物及小沟结合物(MGB)探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏度和稳定性进行检验。利用建立的方法对采集自7个省份31个发病牛场的925份临床样本进行检测,并用基于BCoV N基因的普通RT-PCR结合测序的方法对部分阳性样品进行验证。结果表明：建立的实时荧光定量RT-PCR方法的扩增体系为上下游引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L)0.8μL,2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL,Ex Taq HS (5 U/μL) 0.4μL,Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μL,总RNA 2μL,ddH₂O 4.4μL;扩增程序为,42℃5 min; 95℃10 s; 95℃5 s, 55℃35 s, 40个循环。标准曲线方程为y=40.979-3.512x,可信度(R²)为0.999,扩增效率(E)为92.6%,最低检测限为4...