西宁地区清真屠宰场中除臭菌的分离筛选及初步鉴定

本试验从西宁市清真屠宰场采集牛羊肚粪、屠宰产生的污样本,从中分离纯化菌种,对菌种通过感官试验、菌种的初筛及复筛试验筛选除臭菌株。结果表明,共筛选出2株除臭菌,菌株M3.7与菌株R3.8,菌株M3.7氨气和硫化氢去除率分别为12.03%和55.04%;菌株R3.8氨气和硫化氢去除率分别为43.82%、13.86%。经染色镜检及生化试验初步鉴定,M3.7菌株为短状杆菌属,R3.8菌株为副球菌属。     

一株短小芽胞的分离鉴定及其对屠宰牛血液的降解功能研究

本试验旨在通过筛选高效降解牛血液的菌株,以生物方式降解血液中大分子蛋白物为多肽、氨基酸等小分子产物,再制备为含氨基酸水溶肥料,从而实现屠宰牛血液的无害化环境处理和废弃蛋白资源再利用。本研究以屠宰场血液污泥为分离基质,通过酪素培养基平板和哥伦比亚血琼脂平板筛选出1株能够高效降解血液蛋白的菌株,经形态学特征、生理生化和16S r DNA序列鉴定为短小芽胞（Bacillus pumilus NWMCC0302）,该菌株的16S r DNA序列在GenBank中登录号为OL636364。通过单因素试验确定短小芽胞降解牛血液的关键因素,再采用PlackettBurman试验和Box-Behnken试验设计优化其最佳降解工艺条件。结果表明：降解的关键影响因素为初始pH、麦麸浓度、温度和接种量。最佳降解工艺条件为初始pH 7.39,牛血液体积分数10%(V/V),麦麸浓度21.31 g/L,接种量2.05%(V/V),降解温度38.11℃,对牛血液蛋白的降解率为53.83%。试验筛选出的短小芽胞具有高效降解牛血液蛋白的能力,可以为屠宰废弃血液资源的生物方式处理和循环利用提供候选菌株。     

高活性蛋白酶菌株的选育及发酵培养基的初步优化

试验旨在筛选产高蛋白酶酶活的菌种,用于动物蛋白的酶解。试验从屠宰场的土壤、污泥等地采集样品,采用酪蛋白平板初筛和酶活复筛的方法进行筛选,选取活性较高的菌进行紫外诱变并鉴定,从碳源、氮源、碳氮比和初始pH等方面优化其培养基。结果表明,该菌经紫外诱变后活性提高30%左右,葡萄糖和大豆蛋白胨为其最佳碳氮源,碳氮比为2:1,在初始pH中性条件下产酶较好。反复测定表明该菌遗传稳定性较好,经形态鉴定、16SrDNA和gyrB序列分析鉴定为地衣芽孢杆菌,安全无毒,可进行生产转化。     

屠宰场猪肉中猪霍乱沙门氏杆菌的分离鉴定及16S rRNA的序列分析

为了了解屠宰场生猪肉被沙门氏杆菌污染的情况,试验对采集的20份生猪肉进行细菌分离培养、选择性培养、生化试验、革兰氏染色、沙门氏杆菌外膜蛋白C(Omp C)基因PCR检测等方法进行鉴定,采用MegAlign软件绘制分离菌16S rRNA遗传进化树。结果表明:从屠宰场生猪肉中分离到一株疑似沙门氏杆菌,命名为GZ-Q1株; GZ-Q1株为革兰氏阴性的短小杆菌;生化试验结果与沙门氏杆菌的生化特性基本相符; Omp C基因PCR检测可见约204 bp的目的条带; GZ-Q1株与猪霍乱菌株(CP007639. 1)的同源性最高,为99. 9%。说明从屠宰场生猪肉中分离的GZ-Q1株为猪霍乱沙门氏杆菌。     

上海地区屠宰场猪红斑丹毒丝菌的分离鉴定

为了解上海地区猪红斑丹毒丝菌在健康猪群中的带菌状况,本试验选择上海地区标准化屠宰场的上市猪为研究对象,采集鼻拭子、肺脏、扁桃体和下颌淋巴结等样本,进行猪红斑丹毒丝菌的分离,采用VITEK 2 Compact系统和VITEK MS快速鉴定系统进行鉴定,并设计1对16S rRNA基因引物,对分离菌株进行PCR扩增,随机选取16株分离菌进行测序及16S rRNA同源性分析。结果显示,49.07%（105/214）的样本中分离到猪红斑丹毒丝菌,分离菌株同参考菌株及疫苗株之间16S rRNA同源性为99.6%~100.0%。本试验结果表明上海地区猪群中确实存在猪红斑丹毒丝菌的健康带菌状况。     

鸡肠道芽胞杆菌的分离鉴定及产蛋白菌株的筛选试验

本试验从鸡肠道中分离出菌种50株,通过对菌种菌落培养特性、形态观察、生理生化实验,初步鉴定出8株为芽胞杆菌。经产蛋白菌株的筛选试验筛选出1株能够分泌蛋白的芽胞杆菌,该菌株可望成为外源蛋白高效分泌表达的宿主。     

鸡毛降解菌的分离鉴定

为了筛选降解鸡毛生产蛋白饲料的菌种,试验采用富集分离筛选法,从绍兴富盛山里养鸡场堆砌废羽毛土样中筛选鸡毛降解菌。采用测定发酵液可溶性蛋白和氨基酸含量的方法对分离菌进行复筛,并通过形态学、生理生化反应和16S rDNA测序,对降解能力最强的菌株进行鉴定。结果表明:从养鸡场堆砌废羽毛土样中分离得到11株鸡毛降解菌,CTC385-G8降解能力最强,鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌,说明CTC385-G8是良好的鸡毛降解菌。     

角蛋白降解菌分离、鉴定及其降解机制研究

实验旨在筛选具有高效角蛋白水解活性的微生物,并对其降解羽毛角蛋白机制进行研究,为提高角蛋白生物降解率提供理论指导。采用透明圈和完整羽毛降解相结合的方法,从废弃羽毛中筛选角蛋白降解菌,并进一步研究其羽毛角蛋白降解过程。获得一株可高效降解角蛋白菌株,基于形态观察和16S rDNA分子鉴定,该菌被命名为Bacillus licheniformis CP-7,其5 d可将天然完整羽毛完全降解。CP-7发酵过程产生大量巯基、可溶性蛋白和亚硫酸盐。分离发酵48 h菌株胞内、胞外粗酶液,发现胞外酶液具有较高的角蛋白酶活性,而胞内酶液具有一定二硫键还原酶活性。胞内酶液能够极显著地促进胞外酶液水解角蛋白活性(P<0.01),但对酪蛋白水解活性无影响(P>0.05)。筛选菌CP-7为具有高二硫键还原能力的角蛋白降解菌,二硫键还原酶可能是高效降解羽毛角蛋白的关键。     

鸡肠道芽孢杆菌的分离鉴定及产蛋白菌株的筛选

本实验从鸡肠道分离出50株菌种,通过对菌种菌落培养特性、形态观察、生理生化实验,初步鉴定出8株为芽孢杆菌。通过产蛋白菌株的筛选试验筛选出1株能够分泌蛋白的芽孢杆菌,该菌株可望成为外源蛋白高效分泌表达的宿主。     

盐渍环境微生物矿化碳酸钙技术可行性研究

为了从青海省寒旱环境的盐渍土、水、植物中筛选分离及鉴定可以生产脲酶的耐盐菌,改善青海牧区土壤环境,探索寒旱盐渍土环境中微生物矿化碳酸钙技术的可行性,试验利用5%盐浓度的筛选培养基筛选耐盐菌,从中筛选最优脲酶产生菌,测定其生长曲线和产酶曲线,并进行菌株鉴定及微生物矿化碳酸钙技术可行性测定。结果表明:筛选出200株耐盐菌,其中分离得到1株高产耐盐脲酶产生菌,该菌株在5%盐浓度下的液体培养基中于37℃、180 r/min振荡培养时,其对数生长期出现在4～24 h,最佳发酵时间为48 h,初始酶活性最高达到2.21 U/mL,经鉴定该菌株为木糖葡萄球菌,登录号为MN420830,生成的沉淀为碳酸钙。说明从青海省寒旱盐渍土环境中可以筛选出耐盐脲酶产生菌,且该菌在实验室环境条件下进行微生物矿化碳酸钙技术是可行的。     

一株布氏乳杆菌的分离、鉴定及其特性研究

为寻找抗性菌,以替代部分抗生素,并研究其特性,试验以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌为指示菌,采用牛津杯法从传统发酵食品中筛选出1株对3种病原菌均具有拮抗作用的菌株。利用菌落形态、革兰氏染色、16SrDNA序列分析来鉴定菌株,并测定其生长曲线。结果显示,试验筛选得到了1株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均具有抑制作用的益生菌,经鉴定为布氏乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)。此分离菌为革兰氏阳性菌,单生或成对生长。此菌在抑菌方面具有良好的应用前景。     

产细菌素菌株的筛选鉴定及活性研究

为筛选产细菌素的乳酸菌株,本试验采用高效液相色谱法与微生物学方法相结合的方式进行初步筛选。从土壤中分离获得一株乳酸菌菌株P9-5,将菌株P9-5发酵液作用于单核细胞增生李斯特氏菌发现,其产生的细菌素对该致病菌有抑制活性。结合菌落及菌体形态,通过Biolog自动微生物鉴定系统鉴定和16S r DNA基因序列相似性分析,鉴定菌株P9-5为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus),为菌株P9-5的进一步开发利用提供了技术支持。     

产纤维素酶真菌的筛选与鉴定

为从秸秆中分离出能够降解纤维的菌株,试验采取秸秆样品接种马铃薯琼脂培养基,在室温环境下培养,取分离菌接种纤维素刚果红琼脂培养基,筛选能形成较大降解圈的细菌,并进行形态学和分子生物学鉴定,测定其纤维素酶性质。结果表明,经分子生物学鉴定,筛选菌为黑曲霉菌,该菌在室温环境能够生长,菌株降解圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)为7.64。筛选菌在20 ℃环境下培养5 d酶活达到最高值,为42.18 U/mL。纤维素酶最适pH为7.0,最适反应温度为20 ℃,在20~40 ℃或pH 6.0~8.0环境下作用1 h,相对酶活力仍保持在90%以上。综上所述,本试验分离的黑曲霉菌株是低温产纤维素酶菌株,产酶能力较强,具有潜在的开发价值。     

鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。     

3株非典型羊源布鲁菌的基因分型研究

[目的]探讨采用基因分型方法对非典型布鲁菌鉴定的实用性,为非典型菌株的鉴别提供参考。[方法]采用常规鉴定方法和VITEK 2.0全自动细菌鉴定分析系统对菌株进行初步鉴定,利用AMOS-PCR进行种型鉴定,应用多位点可变数目串联重复序列分析方法(MLVA)确定菌株的基因型。[结果]常规鉴定结果显示试验菌株为疑似布鲁菌;VITEK 2.0全自动细菌鉴定系统显示3株试验菌株均为布鲁菌;AMOS-PCR扩增表明试验菌株均为羊种菌,MLVA聚类分析表明试验菌株与羊种2型布鲁菌紧密地聚为一类,属东地中海基因型,并在Panel 2B中发现了新的基因型(4-4-3-7-5),命名为CN2B-45。[结论]MLVA基因分型方法对非典型布鲁菌具有极高的分辨力,是非典型布鲁菌分型鉴别的最佳策略。     

丁酸梭菌的分离鉴定及生物学特性研究

试验旨在筛选畜禽可利用的优良菌株。从窖泥筛选出2株丁酸梭菌,经过形态学观察、生理生化试验、分子生物学鉴定及同源性比对确定丁酸梭菌,并比较2株丁酸梭菌进行生物学性能。结果显示,菌株J-1产酸种类及产酸量比菌株J-2多,菌株J-1的丁酸产量是菌株J-2的100倍,为411.7 mg/L;菌株J-1和菌株J-2在活菌率方面无明显差异;菌株J-1芽孢率比菌株J-2高17.16%,为77.64%;菌株J-1淀粉酶活性为19.35 mm,比菌株J-2高1.7倍。研究表明,菌株J-1在产酸种类和含量、活菌率、芽孢率、淀粉酶活性方面表现较好,可作为后续试验菌株。     

青贮料中肠球菌的分离与筛选

本试验从青贮料中分离肠球菌并对分离菌株进行初步鉴定与筛选,通过正交试验设计研究不同温度、初始pH和瘤胃液含量对3株分离菌生长的影响,筛选出适合作为奶牛饲用微生物的菌株。结果表明,3株分离菌的最佳培养条件相同为：培养基含葡萄糖2%、蛋白胨1%、瘤胃液20%、初始pH为5.8,接种量为3%,装液量为40 ml, 36℃培养24 h。 在该条件下,3株分离菌的生物量分别为1.9907、1.2963和1.2752。选择生物量最高的1号菌送中科院微生物所鉴定,结果为屎肠球菌。     

一株致病纤维素降解菌的鉴定

为了筛选出高效的纤维素降解菌,实现纤维类饲料的资源化利用,试验采用形态学观察、生化试验、16S rDNA鉴定对奶牛粪便纤维素降解菌进行了研究,同时还测定了该菌株的最优酶活性。结果表明:形态学观察该菌株为革兰氏阴性直杆菌;生化试验初步鉴定其为志贺氏菌属;16S rDNA试验最终确定该菌为革兰氏阴性兼性厌氧志贺氏菌,将其命名为NC007384;在pH值为7、温度为35℃、装液量为40%、接种量为2.5%、摇床转速为180 r/min的条件下培养42 h,志贺氏菌CMCase活性最大,达到21.842 U。     

羊源脲酶产生菌的分离及NS-3菌株的鉴定

为了从羊瘤胃液中筛选出可高效利用尿素的菌株,试验采用平板涂布法以尿素为唯一氮源对健康小尾寒羊瘤胃液进行初筛,对得到的变色圈较大的菌株进行脲酶活性检测和菌株形态特征、生理生化试验鉴定,结合16S rDNA序列分析并与相应种属的标准菌株进行比对,利用MEGA 5. 0构建系统发育树。结果表明:在羊瘤胃液中共分离得到83株具有变色圈的菌株,经纯化后得到9株变色圈较大的菌株,其中脲酶活性较高的菌株命名为NS-3,经鉴定和比对,NS-3菌株与解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella Ornithinolytica)的相似性达到100%,二者在所构建的系统发育树上处于同一个分支,因此最终鉴定NS-3菌株为解鸟氨酸拉乌尔菌。     

竹鼠肠道中厌氧纤维素降解菌的分离与鉴定

本试验旨在从竹鼠肠道中分离厌氧纤维素降解菌并鉴定。取中华竹鼠盲肠内容物稀释,采用含2种不同纤维素[微晶纤维素(MCC)和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)]的培养基在厌氧条件下对纤维素降解菌进行初筛,后又经以纤维二糖为唯一碳源的培养基的多次复筛,选出的菌株进行经形态学和分子生物学的鉴定。结果表明:经过初筛和复筛,筛选出了2株厌氧纤维素降解菌。初筛培养基采用MCC和CMC-Na最终筛选出的2株纤维素降解菌的纤维素酶活力分别为6.599和5.268U/m L。菌株经PCR鉴定、测序,用所得序列构建系统发育树,得出这2株菌与酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)具有很高的同源性,达99%,二者均属于梭菌属(Clostridium)。本试验从竹鼠盲肠中成功筛选出2株纤维素降解菌,经鉴定确定属于梭菌属。