人源抗菌肽LL-37对畜禽病原菌的抑菌活性及体外稳定性研究

测定LL-37对常见畜禽病原菌的抑菌活性及其体外稳定性,并与常用抗生素抑菌活性进行对比。结果表明,LL-37抗菌肽具有广谱的抑菌作用,能够有效抑制细菌生长,但在抑菌效果上弱于常用抗生素如阿莫西林等;LL-37的稳定性较差,在pH=8的碱性环境及消化酶作用的条件下,LL-37的抑菌效果大大降低。研究结果证明LL-37具有一定的抑菌效果,但其抑菌活性和稳定性还有待提高。     

抗菌肽LL-37的抑菌作用及其稳定性研究

采用微量2倍稀释法测定抗菌肽LL-37对大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC),并进一步研究温度、pH和保存时间对LL-37稳定性的影响。结果显示:LL-37对大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为3.12、1.56和0.78μg/mL。热稳定性试验显示:重组抗菌肽121℃加热21 min、100℃加热3 h仍有较好的活性。酸碱稳定性试验结果显示:LL-37在pH 2.0～12.0时均具有一定的活性,pH 5.0～6.0时活性最好。此外,-20℃为此抗菌肽长期保存的最佳条件。     

新疆家蚕抗菌肽（Cecropin-XJ）对奶牛乳房炎病原的体外抑菌效果观察

利用新疆家蚕抗菌肽对奶牛乳房炎病原菌的体外抑菌试验进行药效学观察,确定抗菌肽的抗菌谱,为今后选择新药提供资料和依据。挑选乳房炎的主要病原菌进行药敏试验。先确定抗菌肽的最小抑菌浓度。再将抗菌肽和抗生素进行比较。家蚕抗菌肽对奶牛乳房炎常见病原菌中的革兰氏阳性球菌生长有抑制作用,而对大肠杆菌没有生长抑制作用;与抗生素抑菌圈相比,家蚕抗菌肽抑菌圈较小。结果提示抗菌肽没有抗生素抑菌效果强,但抗菌肽可以减少耐药性,为今后抗菌肽与抗生素联合用药提供依据。     

猪源抗菌肽PR-39对畜禽常见病原菌的抑菌活性及与抗生素协同杀菌效应研究

实验旨在测定猪源抗菌肽PR-39对常见病原菌的抑菌活性,以及其与常用抗生素的协同杀菌效应。实验结果表明:PR-39对常见畜禽病原菌均有一定的抑菌活性,但对革兰氏阳性菌的敏感性较差;将PR-39与阿莫西林、土霉素、硫酸链霉素联合使用效果良好。研究结果为PR-39的实际应用提供理论数据,同时体现出PR-39替代抗生素开发成新型饲料添加剂的巨大潜力。今后可重点研究PR-39的杀菌机制以及联合不同抗生素协同杀菌的相关机理,为抗菌肽在新饲料配方中的使用奠定实验基础。     

抗菌肽与抗生素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的体外协同抗菌效果研究

本试验旨在研究抗菌肽与抗生素联合使用对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的作用效果.通过最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)测定,联合药敏试验,研究牛乳铁蛋白肽(Lactoferricin B,LFcin B)、天蚕素A(Cecropin A)及金霉素、新霉素对大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylo-coccus aureus ATCC25923)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis CMCC50013)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa CMCC10014)的体外协同抗菌效应.结果表明:Cecropin A与LFcin B联合使用对所试革兰氏阴性菌均表现为协同作用,两者联用时的MIC分别是单用时的1/4和1/8～1/4;金霉素与LFcin B联合使用对革兰氏阴性菌和阳性菌表现为协同作用,两者联用时的MIC是单用时的1/8～1/4;另外,Cecropin A与金霉素联合使用对革兰氏阴性菌也表现为协同作用.4种药物的两两合用对受试菌株均不表现拮抗作用.结果提示,LFcin B、Cecropin A及金霉素联合使用对革兰氏阴性菌及阳性菌具有协同作用.     

中草药与抗生素联用对狐狸源大肠杆菌的体外抑菌效果

为了研究2种抗生素(庆大霉素和头孢曲松)和4种中草药(苏木、诃子、秦皮和五味子)对狐狸源大肠杆菌的联合抑菌情况,试验采用改良微量肉汤稀释法和微量肉汤棋盘稀释法分别测定6种药物对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)以及2种抗生素与4种中草药两两联合应用的联合抑菌浓度(FIC)指数,并判定药物抑菌活性及中草药与抗生素联用的抑菌效果。结果表明:6种药物对狐狸源大肠杆菌分离株均有不同程度的抑菌活性,其中头孢曲松抑菌效果最佳;在8种中草药与抗生素联用组合中,头孢曲松和苏木组合在抑菌效果上表现为协同作用;庆大霉素和苏木组合在抑菌效果上表现为相加作用;庆大霉素和秦皮组合在抑菌效果上表现为无关作用;其他联用组合在抑菌效果上则表现为颉颃作用。说明中草药与抗生素联用具有一定的抑菌作用,但要在日常实践中配伍使用,有待于深入的研究。     

P10B抗菌肽和硫酸小檗碱对肉鸡源大肠杆菌的体外联合抗菌作用研究

为了解P10B抗菌肽与硫酸小檗碱联合抗菌作用,进行P10B抗菌肽与硫酸小檗碱联用的体外抑菌试验。试验菌株为20株肉鸡源大肠杆菌菌株。采用微量肉汤稀释法测定P10B与硫酸小檗碱对大肠杆菌的最低抑菌浓度;棋盘稀释法测定两个药的分级抑菌浓度指数,判断联合抗菌效果。结果表明,在联合药敏试验中,两药呈协同作用的占10%,呈相加作用的占85%,呈无关作用的占5%。平均分级抑菌浓度指数为0.825,两种药联和用药效应主要表现为累加作用。     

抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定

为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrII酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168。经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下30min内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL。     

抗菌肽BSN-37的抑菌活性及其稳定性分析

试验旨在研究抗菌肽BSN-37的抑菌活性和稳定性。采用微量倍比稀释法测定抗菌肽BSN-37的最小抑菌浓度(MIC),菌落计数法分析抗菌肽BSN-37对大肠杆菌CVCC1568的杀菌动力学特征,扩散法测定抗菌肽BSN-37的盐离子稳定性、酸碱稳定性、血清稳定性、胰酶稳定性、热稳定性、反复冻融稳定性、室温保持稳定性、药效保持时间稳定性。结果显示,抗菌肽BSN-37对革兰氏阴性菌(大肠杆菌和沙门氏菌)的MIC为1.5625～25μg/mL,对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)的MIC为1.5625～12.5μg/mL,对真菌(白色念珠菌)没有活性;抗菌肽BSN-37可在90min内完全杀灭大肠杆菌CVCC1568;除了Fe2+和胰酶会影响抗菌肽BSN-37的抑菌活性外,在75～100℃的高温、150～250mmol/L高浓度盐离子(Na+、K+、Ca2+和Mg2+)、20%～25%饱和浓度的Cu2+、pH 4～10、20%～25%的血清、10～12次的反复冻融、10～12d室温保存等条件下仍能保持较好的抑菌活性,药效保持时间可达7.5d。本试验结果表明,抗菌肽BSN-37具有替代抗生素成为新抗菌药物的潜力,为抗菌肽BSN-37的临床应用提供了理论依据。     

富含亮氨酸和精氨酸的抗菌肽设计

通过构建亮氨酸疏水面和精氨酸亲水面来设计全新的抗菌肽,并评估利用这种螺旋轮投影模型设计出的抗菌肽的生物学活性.检测了设计得到的新型抗菌肽LGR16的最小抑菌浓度(MICs)、对于红细胞和哺乳动物细胞的细胞毒性以及杀菌动力学.结果表明,新型抗菌肽LGR16具有很强的抗菌活性,其对于革兰氏阴性菌和阳性菌的最小抑菌浓度分别为8和4 μg·mL-1.LGR16杀菌速度快,在10 min内能杀死细菌.在最小抑菌浓度该抗菌肽只表现出很弱的溶血活性和对哺乳动物细胞的细胞毒性.综上可见,抗菌肽能够通过在螺旋轮中聚集疏水性或者碱性氨基酸残基来设计,而且本研究得到的抗菌肽LGR16具有替代抗生素的潜质.     

抗菌肽BSN-37的抑菌活性及其稳定性分析

试验旨在研究抗菌肽BSN-37的抑菌活性和稳定性。采用微量倍比稀释法测定抗菌肽BSN-37的最小抑菌浓度(MIC),菌落计数法分析抗菌肽BSN-37对大肠杆菌CVCC1568的杀菌动力学特征,扩散法测定抗菌肽BSN-37的盐离子稳定性、酸碱稳定性、血清稳定性、胰酶稳定性、热稳定性、反复冻融稳定性、室温保持稳定性、药效保持时间稳定性。结果显示,抗菌肽BSN-37对革兰氏阴性菌(大肠杆菌和沙门氏菌)的MIC为1.5625～25μg/mL,对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)的MIC为1.5625～12.5μg/mL,对真菌(白色念珠菌)没有活性;抗菌肽BSN-37可在90min内完全杀灭大肠杆菌CVCC1568;除了Fe2+和胰酶会影响抗菌肽BSN-37的抑菌活性外,在75～100℃的高温、150～250mmol/L高浓度盐离子(Na+、K+、Ca2+和Mg2+)、20%～25%饱和浓度的Cu2+、pH 4～10、20%～25%的血清、10～12次的反复冻融、10～12d室温保存等条件下仍能保持较好的抑菌活性,药效保持时间可达7.5d。本试验结果表明,抗菌肽BSN-37具有替代抗生素成为新抗菌药物的潜力,为抗菌肽BSN-37的临床应用提供了理论依据。     

牛乳源肽Lfcin B抗菌活性、稳定性及协同效应研究

为了探讨绿色安全抗生素替代品牛乳源肽(Lactoferricin Bovine,Lfcin B)的抗菌活性、稳定性及其与抗生素协同效应。检测Lfcin B与三种抗生素对常见致病菌的最小抑菌浓度与最小杀菌浓度;采用棋盘法分析Lfcin B与抗生素联合使用效果;测定不同温度与pH值对Lfcin B抑菌活性影响。实验结果表明:Lfcin B和抗生素对常见畜禽致病菌均具有良好抑菌活性,对金黄色葡萄球菌的MIC值为8μg/mL;Lfcin B和阿莫西林联合使用存在协同效应,对大肠杆菌和猪霍乱沙门氏菌的分级抑制浓度指数(fractional inhibitory concentration index, FIC指数)达到0.312 5;Lfcin B的热稳定性和酸碱稳定性良好,在40～60℃和p H 6～8的条件下对金黄色葡萄球菌的MIC值保持在8μg/mL。结果提示,Lfcin B具有成为新型饲用抗生素替代品的巨大潜力。     

鹿白细胞抗菌肽的体外抗菌试验

应用氯化铵裂解、超声波破碎和离子交换层析等方法，从鹿白细胞中提取出阳离子抗菌肽混合物。经平板抑菌试验初步检测其抗菌活性后，采用微量反应板法测定了鹿抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等9个标准菌株的最小抑菌浓度（MIC），结果显示，该混合抗菌肽对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均具有抑制活性。体外杀菌曲线试验表明，鹿抗菌肽的杀菌作用是非浓度依赖性的，杀菌效果迅速，可在2min内杀灭63．8％的受试细菌。     

一种快速检测抗菌肽与饲用抗生素协同抑菌关系的方法

虽然抗菌肽是具有广谱杀菌作用的免疫分子,但仍不能完全取代抗生素,由于抗菌肽和抗生素的抗菌机制不同,他们间的联合使用是目前主要的研究内容。研究旨在通过牛津杯法快速判断抗菌肽产品与5种抗生素间联合抑菌关系,同时研究不同革兰阴性微生物对联合抑菌的影响。试验结果表明:牛津杯法可快速检测出抗菌肽与抗生素间的协同作用关系,且受不同条件的影响小,但协同作用的抑菌能力会受微生物的影响。     

中草药与抗生素联用对猪源沙门氏杆菌的体外抑菌效果观察

为了评价常用抗菌药物和中草药以及联合作用后对猪源沙门氏杆菌的体外抑菌效果,试验采用醇提法提取中药有效成分,用试管二倍稀释法分别测定6种抗生素和7种中草药对猪源沙门氏杆菌的最小抑菌浓度(MIC),用棋盘法测定各药物联合作用的抑菌效果。结果表明:阿米卡星对沙门氏杆菌的抑菌效果最强(MIC为4μg/mL),其次为诺氟沙星与链霉素(MIC为128μg/mL)。在中草药中,乌梅的抑菌效果最强(MIC为31.25 mg/mL),其次为连翘(MIC为62.5 mg/mL)。联合药敏试验结果表明,头孢噻肟分别与阿米卡星、诺氟沙星联合,阿米卡星与氟苯尼考联合,乌梅与艾叶联合均表现为协同作用;阿米卡星分别与诺氟沙星、乌梅、连翘联合,乌梅分别与诺氟沙星、氟苯尼考联合均表现为相加作用;其他药物组合均表现为无关或颉颃作用。说明可通过联合用药减少用药剂量达到治疗疾病的目的。     

抗菌肽CJH对常见畜禽病原菌抑菌活性及与抗生素协同杀菌效应研究北大核心

抗菌肽CJH是从金环蛇毒液中提取出的一种抗菌活性极强的免疫活性多肽物质。试验测定了抗菌肽CJH对不同革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌活性及杀菌速率,并与常用抗生素的测定结果进行了对比;通过微量肉汤稀释棋盘实验法测定了抗菌肽CJH联用不同抗生素的杀菌效果。结果表明:相比几种常用抗生素,抗菌肽CJH具有广谱的抗菌活性,且杀菌能力较强;抗菌肽CJH与阿莫西林、土霉素联用有协同效应。试验为抗菌肽CJH的实际应用及为了探明其减少甚至替代抗生素成为新型饲料添加剂的潜力提供参考。     

黑水虻抗菌肽对曲霉和沙门氏菌的抑制作用及其营养成分研究

为研究黑水虻抗菌肽对曲霉和沙门氏菌的抑制作用及其营养成分，本试验通过微量肉汤稀释法和分光光度计法对最低抑菌浓度和抑菌曲线进行了比较。结果表明：抗菌肽对沙门氏菌的最低抑菌浓度为2.5 mg/mL，在此浓度下黑水虻抗菌肽对黑曲霉也有较强的抑制效果，处于最低的抗菌肽对沙门氏菌的抑制时间为32 h(P <0.01)；使用场发射扫描电子显微镜对黑水虻抗菌肽作用前后病原菌形态进行观察，证明抗菌肽作用于病原菌膜结构，在膜上形成离子通道，造成病原菌内容物流出，从而导致病原菌死亡;采用酸水解和2,4二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法对抗菌肽氨基酸组成进行分析，结果显示必需氨基酸含量占比约为50%。抗菌肽粗提物具有抑菌作用强，对环境友好，无富集无残留，营养全面等优点，十分适宜作为饲用抗生素的替代物。     

3种抗菌药对沙门氏菌的体外联合抑菌试验

采用2倍稀释法测定氟苯尼考、氧氟沙星及TMP等3种抗菌药物对沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC),再用棋盘法测定3种抗菌药物的两两联合对沙门氏菌的体外抑菌效果。试验结果显示:氟苯尼考、氧氟沙星、TMP对沙门氏菌最小抑菌浓度MIC分别为8μg/mL、1μg/mL、256μg/mL;氟苯尼考与TMP联合表现为协同作用,氟苯尼考与氧氟沙星为无关作用,氧氟沙星与TMP为拮抗作用,表明氟苯尼考和TMP可联合应用于治疗畜禽的沙门氏菌感染。     

蛙源抗菌肽Magainin Ⅱ对畜禽常见病原菌抑菌活性与体外稳定性测定

抗菌肽MagaininⅡ是来源于非洲爪蟾体内的一种具有抗菌活性的小肽类物质。试验采用微量肉汤稀释法测定蛙源抗菌肽MagaininⅡ对几种常见畜禽致病菌的抑菌活性;在此基础上将抗菌肽MagaininⅡ在不同温度、pH值及人工胃蛋白酶与胰蛋白酶进行处理,进而评价其稳定性。试验结果表明,抗菌肽MagaininⅡ对革兰氏阳性菌不具有抑菌作用,但对几种革兰氏阴性菌表现出一定的抗菌活性,MIC值处于64~256μg/ml;由时间杀菌曲线可知,MagaininⅡ不能有效抑制金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌落的形成,但能够在90 min内对大肠杆菌ATCC 25922发挥抑制作用;MagaininⅡ的稳定性测试结果表明,分别经不同温度、pH值以及人工胃蛋白酶与胰蛋白酶处理后的MagaininⅡ对金黄色葡萄球菌ATCC 29523和表皮葡萄球菌ATCC 12228始终没有发挥抑菌活性,在经50~70℃处理后能够对大肠杆菌K12和肠炎沙门氏菌CMCC 50041稳定发挥抗菌效果,MIC值始终为64μg/ml;经两种人工酶处理后的MagaininⅡ对两种试验革兰氏阴性菌不再具有抑菌作用;经pH值为2处理后,MagaininⅡ对大肠杆菌K12和肠炎沙门氏菌CMCC 50041的MIC均为256μg/ml,比未处理时明显增大,经pH值为8处理后,MagaininⅡ不能抑制大肠杆菌K12,对肠炎沙门氏菌CMCC50041的MIC为128μg/ml。基于试验结果可推断:MagaininⅡ对革兰氏阳性菌抗菌效果不明显,对革兰氏阴性菌具有一定的抗菌效果,经人工酶处理后性质不稳定,该研究为MagaininⅡ在畜禽生产上的应用提供参考。     

天蚕素抗菌肽体外抑菌及肉鸡饲喂效果观察

为评估肉鸡日粮中添加抗菌肽替代抗生素的饲用效果,本试验先对1种天蚕素抗菌肽进行了体外抑菌试验,然后进行了肉鸡饲喂试验。用微量稀释法测定了天蚕素抗菌肽对大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。结果表明,天蚕素抗菌肽对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别是20μg/mL、20μg/mL和40μg/mL。在肉鸡饲喂试验中,饲料中添加150mg/kg的天蚕素抗菌肽可以促进肉鸡生长,降低发病率。