猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒系统表达及鉴定

通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(pcv-2)中的缺失核定位序列的ORF2基因,将其克隆到Bac-N-Blue杆状病毒表达系统的pMelBacB载体中,得到阳性重组质粒pMel-ORF2。将其与Bac-N-Blue DNA体外重组,在脂质体的介导下,转染处于对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒并在Sf9细胞上表达重组蛋白。通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光法(IFA)鉴定表明,Cap蛋白在昆虫-杆状病毒系统获得了表达,为Cap蛋白作为pcv-2检测抗原进行猪圆环病毒特异性抗体的检测提供了物质基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.     

构建表达猪瘟病毒E0基因的重组杆状病毒

为了得到可溶性重组猪瘟病毒E0蛋白并便于观察重组蛋白的表达情况,将增强型水母绿色荧光蛋白基因(EGFP)与E0基因相连插入昆虫杆状病毒转移载体中,与线性杆状病毒DNA共转染Sf9细胞后通过噬斑纯化得到纯的重组杆状病毒,将其感染Sf9细胞制备P1种子液,同时用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,剔除表达效果差的重组杆状病毒。再用P1种子液感染Sf9细胞制备高效价的P2种子液。通过病毒液的梯度稀释和噬斑测定,确定P2种子液的病毒滴度达1.14×107pfu/mL。将P2种子液以MOI 5~10接种指数期Sf9细胞,3 d后呈现出最强的荧光。重组杆状病毒在Sf9细胞中的初步成功表达为进一步制备重组E0糖蛋白,研究E0蛋白的结构与功能、免疫诊断新方法和猪瘟基因工程疫苗奠定基础。     

乙型脑炎病毒的分离与鉴定

通过收集母猪流产死胎和蚊子为病料 ,用乳鼠脑内接毒和细胞接毒相结合的方法盲传并分离出病毒 ,进而采用血凝 (HA)实验、荧光抗体染色技术 (间接法 )、电镜实验、血清学实验及RT -PCR方法对所分离的病毒进行鉴定 ,结果表明所分离的病毒SC株为乙脑病毒 ,其PrM/E的同源性与JEV强毒株SA14相比达 98%。     

新城疫病毒F48E9株和La Sota株F基因在Bac-to-Bac昆虫杆状病毒系统中的表达

将新城疫病毒(F48E9株和La Sota株)F基因插入至杆状病毒转移载体pFastBacTMHT A中,分别构建重组质粒pFastBacHT-F48F,pFastBacHT-LaF,然后转化E.coliDH5α,以LB/AMP±平板筛选阳性重组子并测序。测序正确后转化至E.coliDH10Bac感受态细胞中,经抗性培养和蓝白斑筛选,筛选出白色菌落后,提取重组Bacmids(分别命名为rBacmid-F48F和rBacmid-LaF),经PCR鉴定正确后,将阳性重组Bacmids转染Sf9昆虫细胞。在昆虫细胞内,重组Bacmid经复制,表达,装配,形成重组杆状病毒,经SDS-PAGE和Western-blot分析,证实NDV F48E9株和La Sota株的F蛋白均获得正确表达,所表达的重组F蛋白分子量约56 kD,证明在昆虫细胞内表达并部分糖基化,具有良好的免疫原性,为表达F基因并建立适合国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础。     

日本乙型脑炎病毒分离株E基因的克隆及序列分析

[目的]对日本乙型脑炎病毒分离株E基因进行克隆及序列分析。[方法]根据乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株序列,设计并合成一对E基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增出JEV分离株E基因片段,将其与pMD19-T载体连接,应用DNAStar、Clustal_1.81和Mega序列分析软件进行同源性比较。[结果]分离株E基因的cDNA长1 500 bp,可编码500个氨基酸;分离株E基因与VN50/Viet Nam/1989/Hu-man brain株、SA14株、Whe株、Benjing 1株、P3株、KV1889株J、aGAr01株和SA14-14-2株的核苷酸同源性为88.0%～99.1%,氨基酸同源性为97.8%～99.8%;分离株为乙型脑炎病毒强毒株。[结论]该研究为乙脑病毒基因工程疫苗的研发奠定了一定的基础。     

H9N2型禽流感病毒HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

采用异硫氰酸胍法提取禽流感病毒分离株的SPF鸡胚尿囊毒RNA,利用RT-PCR技术扩增出禽流感病毒HA基因的cDNA。将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后,亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis,筛选到重组质粒,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-NBlueTMDNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rpBlueBacHisH9HA。提取重组病毒DNA,经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中,血凝实验、SDS-PAGE实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的Highfive细胞中获得了表达。     

猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据猪乙型脑炎病毒(JEV)基因序列,设计合成了一对引物,以JEV疫苗株为模板,建立了检测JEV的RT PCR方法。应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为430 bp的特异性目的片段;RT PCR产物测序结果与文献报道的JEV不同毒株的序列同源性达到98%~100%;敏感性测定该RT PCR可扩增到10 pg的JEV-RNA。结果表明,建立的RT PCR方法对JEV的检测敏感性高、特异性强。     

siRNA对乙型脑炎病毒复制的抑制效果

以JEV的NSl基因mRNA为靶序列,设计合成了4个siRNA序列,构建了各自的表达质粒pS-NSlA、pS-NSlB、pS-NSlC和pS-NSlD.通过间接免疫荧光、Western blot检测、RT-PCR和病毒空斑检测等方法对这些siRNAs抑制JEV复制的效果进行了评价.结果表明4个siRNA表达质粒均对JEV在细胞中的复制具有不同程度的抑制作用,其中pS-NSlC、pS-NSlD有显著的抑制作用.说明针对NSl基因的siRNAs可以有效抑制JEV的复制,并有望成为应对JEV感染的治疗方法.     

水稻瘤矮病毒S3和S8基因共表达杆状病毒转移载体构建及重组病毒的鉴定

为构建携带水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)主要内层衣壳蛋白S3基因和外层衣壳蛋白S8基因的重组杆状病毒,将目的基因(S3和S8)分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子(PH)和p10启动子的下游.经酶切和确证性序列测定,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,...     

日本乙型脑炎病毒对干扰素诱导基因ISG15表达的影响

为研究机体干扰素诱导基因对日本乙型脑炎(JEV)感染的作用,通过IFN-α和JEV刺激猪睾丸(ST)细胞,实时荧光定量PCR检测Mx1、Mx2、OAS1、OAS2、PKR和干扰素诱导基因-15(ISG15)表达情况,发现除PKR外,其他基因相对mRNA量都有不同程度上升,其中ISG15上升最为显著。ISG15在ST细胞中过表达,检测病毒基因组和滴度,结果表明:ISG15可显著抑制JEV增殖;shRNA靶向干扰ISG15,JEV病毒量上升,说明ISG15在体外对JEV的增殖有抑制作用。将JEV的C、M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B基因克隆入pcDNA3.1真核表达载体,转染ST细胞后E和NS3基因引起ISG15相对mRNA量显著上升,说明JEV的E和NS3基因参与诱导ISG15的表达。     

NS2A序列对日本脑炎病毒NS1基因在原核系统中的体外表达的影响

 用RT-PCR扩增并克隆了日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的NS1、NS1'、NS1-2A的 cDNA片段,分别将其亚克隆到原核表达载体pET-30b(+),构建了重组原核表达质粒pET30b-NS1、pET30b-NS1'、pET30b-NS1-2A,转化大肠杆菌BL-21(DE3),用IPTG诱导培养。结果表明,仅有pET30b-NS1质粒转化的菌株获得表达,而另外2种重组质粒转化的菌株均无表达。表达的融合蛋白分子量约为46kD,约占菌体总蛋白的30.8%,Western blotting分析表明表     

猪乙型脑炎病毒广西分离株FC792E基因主要抗原域的原核表达及抗原性鉴定

对广西猪JEV FC792株的E基因主要抗原域Ⅰ、Ⅱ基因(Ea基因)进行原核表达及抗原性鉴定,为猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)诊断抗原和基因工程疫苗的研制奠定基础.结果:成功构建广西猪JEV FC792株Ea基因的克隆重组质粒pMD18-T-Ea及表达重组质粒 pET32a-Ea,经SDS-PAGE及Western blot鉴定表明,JEV FC792株Ea蛋白在Roetta(DE3)菌中成功进行融合表达,表达出约58 KDa的融合蛋白;经抗原性鉴定表明,表达的融合蛋白Ea能与猪JEV阳性血清抗体发生特异性反应,融合蛋白Ea具有良好的JEV抗原性.     

猪乙脑快速诊断方法的建立与应用

根据乙脑病毒基因组3′末端保守区设计一对特异性引物,建立了乙脑病毒不同株的RT-PCR诊断技术.该技术可以从乙脑病毒WHe株、SA14-14-2株、P3株、SA14-14-2VS株接种的鼠脑组织中扩增出486bp的核酸片段,检出的灵敏度约为2pg.对20份临床样品的检测结果与小鼠脑内接种试验(MIT)的测定结果完全吻合,但RT-PCR诊断技术可在3h内直接对组织进行诊断,具有敏感、快速、稳定的优点.     

猪乙脑病毒HW株的全基因组克隆及分析

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种中枢系统人畜共患急性传染病,由蚊为媒介传播,以高热和狂暴或沉郁等神经症状为特征[1],猪患乙型脑炎的主要症状表现为怀孕母猪流产,产死胎或弱仔,公猪则患睾丸炎,仔猪呈神经症状,使养猪业遭受巨大损失。1988年我国学者方     

鸭圆环病毒Cap 基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定

通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。     

表达带His-tag的禽流感病毒HA基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A／Goose／GuangDong／1／96（H5N1）1．7kb HA基因的eDNA将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis4．5，筛选到重组质粒命名为rpBacHisH5HA。测序正确后，在脂质体介导下，与线性化的杆状病毒ENA（Bac-N-Blue TMDNA）共转染Sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rBacHisH5HA。提取重组病毒DNA经PCR证明目的基因片段已插入杆状病毒基因组。     

乙脑病毒CN株PrM/E基因的克隆及序列分析

通过RT -PCR扩增乙型脑炎病毒CN株主要抗原基因PrM /E ,并将PrM /E基因克隆、测序后 ,与GenbanK发表的JEVSA14 (U14 16 3)基因序列进行比较分析 ,发现CN株与JEVSA14强毒株的同源性为 98%。在JEV基因组 5′端 4 77～ 2 4 77的长 2 0 0 0nt的决定JEV抗原性的PrM /E区中 ,CN株与SA14株有 4 0个碱基不同 ,其中 2 8个碱基突变为同义突变 ,另外 12个为错义突变 ,导致相应的氨基酸序列 (6 6 6个 )中的 4个氨基酸发生了突变 ,其中有 2个氨基酸出现在含有关键的抗原决定簇的E蛋白内 ,但不影响其功能表达     

Phylogeny and Homologous Recombination in Japanese Encephalitis Viruses

Japanese encephalitis virus (JEV) is a significant causative agent of arthropod-borne encephalitis and what is less clear that the factors cause the virus wide spread. The objective was to confirm whet...