一段烟草核基质结合区的分离及对转基因表达的效果

 采用PCR方法，从烟草基因组中分离了一段核基质结合区（matrix attachment region，MAR），将其构建到β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因（uidA）的两侧翼，形成MARs调控的植物表达载体，将此表达载体与不含MARs序列的植物表达载体通过农杆菌转化烟草。对转基因植株进行GUS活性定量测定，结果表明，MAR可以提高外源uidA基因的表达水平，与不含MAR的转化植株相比，外源基因的平均表达水平提高了1.5倍，最高达6倍，但MAR的引入不能降低转基因植株个体间表达水平的差异。     

利用核质结合区(MAR)增强外源转基因表达的研究进展

核质结合区(Matrix attachment region,MAR)是真核细胞染色质中与核基质结合的一段DNA序列。当大多数染色质蛋白和其他DNA被切割降解后,MAR仍能和核基质结合,或者能在竞争性DNA片段存在的条件下,在体外与纯化的核基质结合。将MAR构建于外源基因两侧时,能够增强外源基因的高效稳定表达,减少基因沉默。笔者评述了近年来应用MAR序列提高外源转基因在受体植物中表达的最新进展,分析了存在的问题。同时,对如何进一步应用MAR于转基因作物,提高外源转基因的功能表达进行了展望。     

转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用

[目的]探讨转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用。[方法]将PCR扩增得到的人β-珠蛋白MAR插入到真核表达载体pCATG的下游,构建转基因表达盒3’端含MAR的表达载体。酶切鉴定正确后,转染CHO细胞,G418筛选出稳定转化的细胞株,ELISA分析转基因的表达水平,半定量PCR分析转基因相对拷贝数。[结果]结果表明,表达盒3’端含MAR序列能使转基因表达水平降低,其基因拷贝数则有一定程度的增加。转基因下游β-珠蛋白MAR在一定程度上能抑制外源基因的表达水平;外源基因表达量与基因拷贝数不成正比,未呈现出“拷贝数依赖性”。[结论]该研究结果为进一步研究MAR的调控机制奠定基础。     

一种对转基因植物基因表达进行检测的新方法

介绍了对一种检测转基因植物基因表达的新方法－－蛋白免疫原位杂交法，该法与常规的Westernblot相比，具有操作简便，有效可行，所需仪器少等特点，适用于在翻译水平上对转基因植物进行了检测。     

外源基因在转基因植物中的表达

概述了外源基因在转基因植物中的表达特点，性能及影响外源基因表达的因素。     

人孕酮受休激素结合区基因表达产物的检测与制备

ＰｕＰＲ为含有编码人孕激素受体（ｈＰＲ）激素结合区（ＬＢＤ）基因（６３１－９３３氨基酸）的ｐＵＣ１９重建质粒,在其宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）中,经１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导,该转化的细菌产生一Ｃ端为６×Ｈｉｓ结尾的蛋白质,分子量４５ＫＤ。该表达产物可利用Ｎｉ－ＮＴＡ ＨＲＰ在ｎｇ水平用Ｗｅｓｔｅｍ印迹检测,并可通过亲和层析的方法,利用Ｈｉｓ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｓｉｎ（Ｎｉ     

实现转基因植物外源基因高表达的途径与安全性

近十年来,许多重要作用品种的遗传转化相继成功和得到可育的转基因植株,多种不同外源基因被导入大量不同植物。但由基因沉默、位置效应等原因,外源基因在转基因植株中不表达或表达水平低下,同时不同植株个体之间也存在差异。因此如何在转基因植株中实现有效表达和维持高水平稳定遗传,就是农业生物技术工作者面临的首要问题。     

人孕酮受体激素结合区基因表达产物的检测与制备

PuPR为含有编码人孕激素受体（hPR）激素结合区（LBD）基因（631-933氨基酸）的pUC19重建质拉,在其宿主Escherichiacoli（BL21）中,经1mmol/L的IPTG诱导,该转化的细菌产生一C端为6×His结尾的蛋白质,分子量45KD。该表达产物可利用Ni-NTAHRP在ng水平用Western印迹检测,并可通过亲和层析的方法,利用His－bindingresin（Ni树脂）从菌体的裂解液中方便地回收到该蛋白质。     

植物转基因沉默及其克服方法研究进展

转基因沉默可分为转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默，前者是因为启动子失活，不能起邕，而后者是因为mRNA被被解，或mRNA的加工被干扰，其原因包括多种因素，如转基因的拷贝数和构型，基因的甲基化，异染色质化，RNA依赖的RNA聚合酶等，涉及DNA－DNA，DNA－RNA，RNA－RNA三种核酸相互作用。克服转基因沉默的方法包括对外源基因进行改造，采用具有特殊功能的启动子与增强子，构建细胞核骨架附着区载体，以及筛选单拷贝转基因子代植株。     

增强外源基因在转基因植物中表达的策略

在转基因研究和生产应用中,人们往往期待目的基因能在转基因生物中高效表达从而实现相关目的--获得具有对杀虫剂、除草剂高抗性的农作物,或以植物作为生物反应器生产具有高附加值的疫苗、抗生素等医药用品以及工业用蛋白、酶类等。综述了各种用于增强外源基因表达效率的策略,从外源基因的整合、转录水平的调节以及外源基因翻译后的蛋白分选三个水平阐述提高外源基因表达的相关策略的利弊,从而为转基因研究提表达供载体构建方面的参考依据。     

Expression of an Episomal Vector in Developing Chicken Embryo and Chicks

The domesticated chicken has important roles in basic and applied research. The vector based on scaffold matrix attachment region （S/MAR） appears to be sufficient to maintain long-term expression in an episomal state in various mammalian cells. To explore the practical use of episomal vector in transgene technology of agricultural chickens, we fused the S/MAR of the human r-interferon gene into the pEGFP vector and transduced it into chickens by sperm-mediated gene transfer （SMGT）. PCR detection indicated the positive rate of transgene chickens was 60%. The RT-PCR detection and fluorescence observation confirmed the expression of the GFP and indicated the existence of the GFP during the chicken embryogenesis and fetal development. The PCR detection and rescue experiments confirmed the episomal state of the pEPI-EGFP in chick embryos and chicks. These results showed that the S/MAR-based vector could function properly in chicken embryos and was a practicable tool combined with the SMGT to study the development of chickens.     

甘蓝短散布元件对转基因表达效果的研究

为检验甘蓝短散布元件(SINE)对植物转基因表达的影响,采用PCR方法,从甘蓝基因组中克隆了一段短散布元件序列(Short Interspersed Nuclear Element,SINE),该SINE具有核基质结合区(matrix attachmentregion,MAR)的结构特征,将其构建到β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)的两侧翼,形成SINE调控的植物表达载体,采用农杆菌介导法,将含SINE序列和不含SINE序列的植物表达载体导入烟草中。对转基因植株进行GUS活性定量测定,结果表明,SINE表现出类似MAR的功能,可以提高外源uidA基因的表达水平,与不含SINE的转化植株相比,外源基因的平均表达水平提高了2倍,但转基因植株个体间表达水平存在较大的差异。     

转manA基因小鼠F1代表达效果的检测分析

将携带茁-甘露聚糖酶基因manA 的转基因FVB 原代小鼠与“生型FVB 小鼠进行繁殖得到F1代,通过 PCR 和Southern blot 鉴定出F1代转基因小鼠。提取转基因小鼠腮腺、舌下腺、下颌下腺、心脏、肝脏等组织的总RNA, 通过RT-PCR 检测出manA 在转基因小鼠的腮腺和舌下腺组织特异性表达。进行定量PCR 验证出manA 基因在302 号家系小鼠的舌下腺中表达量最高,证明茁-甘露聚糖酶基因manA 在转基因小鼠的腮腺和舌下腺特异性表达成功。 对转基因小鼠唾液进行收集测定茁-甘露聚糖酶活性,在302 号家系中检测到酶活性较高。通过代谢试验测定饲料 中粗蛋白、粗纤维和粗脂肪的消化率,结果显示,与非转基因小鼠相比,302 号家系转基因小鼠对饲料中粗蛋白、粗纤 维的表观消化率无明显差异,而粗脂肪的消化率得到显著提高;304 号家系转基因小鼠对饲料中粗蛋白、粗脂肪、粗 纤维消化率方面均无明显差异。     

甘蓝短散布元件对转基因表达效果的研究*

 为检验甘蓝短散布元件（SINE）对植物转基因表达的影响,采用PCR方法,从甘蓝基因组中克隆了一段短散布元件序列（Short Interspersed Nuclear Element,SINE）,该SINE具有核基质结合区（matrix attachment region,MAR）的结构特征,将其构建到β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase,GUS）基因（uidA）的两侧翼,形成SINE调控的植物表达载体,采用农杆菌介导法,将含SINE序列和不含SINE序列的植物表达载体导入烟草中。对转基因植株进行GUS活性定量测定,结果表明,SINE表现出类似MAR的功能,可以提高外源uidA基因的表达水平,与不含SINE的转化植株相比,外源基因的平均表达水平提高了2倍,但转基因植株个体间表达水平存在较大的差异。     

马铃薯StERF3超量表达载体转基因植株矮化原因初探

基于马铃薯StERF3超量表达载体转基因株系中出现了部分矮化植株,通过基因表达量检测、组织切片分析和转基因试管苗添加外源生长调节剂等方面对矮化原因进行了初步探讨.结果表明:矮化株中StERF3基因表达比对照降低;矮化株木质部和薄壁细胞明显变小,栅栏组织和海绵组织较致密;培养基中添加0.5 mg/mL GA3能够使矮化株...     

合浦珠母贝不同壳基质蛋白基因的表达水平比较

采用荧光定量PCR 技术分析了不同壳基质蛋白基因之间的表达水平差异,组织表达特征以及育珠对表达水平的影响。结果显示,msi31,aspein,msi7 基因只在外套膜组织中表达;nacrein 和n19 基因除在外套膜表达外,在珍珠囊中也有表达;而accbp 在外套膜、闭壳肌、性腺、消化腺、腮和珍珠囊中都有表达,在外套膜中表达量最高,其次为性腺。accbp、msi31、msi7和nacrein基因在育珠贝和非育珠贝外套膜中的表达水平有显著性差异,aspein与n19 无显著性差异;其中msi31 基因在育珠贝外套膜的表达量上调,accbp尧msi7与nacrein 下调。不论在育珠贝还是非育珠贝的外套膜组织中,msi31的表达水平最高,n19 最低;但在珍珠囊中n19的表达量最高,且远高于在外套膜中的表达水平。     

鲤春病毒血症病毒基质蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组序列(GenBank:NC_002803),人工合成M基因开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化工程菌株BL21 (DE3),在0.1 mmol·L-1 IPTG、37℃下诱导5h,获得高效表达的M蛋白,但其主要以包涵体的形式存在,经超声破碎、包涵体纯化后,再...     

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。