花生AhHDA1互作蛋白AhGLK的筛选及特性分析

通过酵母双杂交系统,以花生组蛋白去乙酰化酶AhHDA1为诱饵,对花生cDNA文库筛选并分析互作蛋白的生物学特性。结果获得一个AhHDA1互作蛋白Arachis hypogaea L.Golden 2-like(AhGLK);体外荧光双分子试验证实,AhHDA1与AhGLK蛋白存在相互作用;利用生物信息学软件分析表明,AhGLK含有MYB保守域,其氨基酸序列与大豆(Glyine soja)GsGLK、拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGLK分别具有较高同源性;AhGLK定位在细胞核中并具有转录因子活性,主要在花生的叶片中表达;在30%PEG条件下,AhGLK表达下调。     

巴西橡胶树乳管细胞中与HbMago2相互作用蛋白的筛选与分析

为探索HbMago2在乳管细胞中的作用,本研究构建了HbMago2的诱饵载体,从巴西橡胶树乳管cDNA表达文库中筛选与HbMago2相互作用的蛋白。结果显示,诱饵载体无自激活性、对酵母菌Y2HGold无毒性;通过文库筛选,获得3个与HbMago2相互作用的蛋白;点对点验证结果表明HbMago2能够与Y14、phox和HMAD在酵母中能相互作用。互作蛋白中phox是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH)的亚基,NADPH氧化酶能引起ROS,而重金属相关结构域蛋白(HMAD)能清除重金属引起的ROS,推测HbMago2通过蛋白互作协调乳管细胞中ROS的平衡。本研究结果为进一步研究HbMago2在乳管细胞中的功能提供重要的研究基础。     

成熟期番茄果实cDNA文库的构建及SlHSP17.7互作蛋白的筛选

植物小分子热激蛋白(small heat shock proteins, s HSPs)是一种多样、古老的蛋白家族,分子量大小普遍在12~42 k D之间,包含典型的C端、N端和α晶状体蛋白域。s HSPs作为一种重要的分子伴侣在植物生长发育和响应逆境胁迫中起着重要的作用。本研究通过构建成熟期番茄果实cDNA文库,筛选与SlHSP17.7互作的蛋白,进而探索SlHSP17.7在果实发育进程中的分子机制。以Micro-Tom番茄绿熟期、转色期和完熟期果实cDNA为模板,构建番茄果实c DNA文库。构建pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体筛选与其互作的蛋白,利用酵母双杂交实验验证互作关系。经检测番茄果实cDNA文库库容是2.2×10~6CFU,工作液细胞密度是3.6×10~7cell/mL,均一化程度>106,结果符合质控要求。将pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体转化Y2HGold酵母菌株检测发现,其无毒性和自激活现象,经筛选c DNA文库、测序及序列比对分析得到钙阳离子交换体SlCCX1-like蛋白,利用酵母双杂交实验验证发现二者存在互作关系。经PCR鉴定后,所建文库质量良好,文库的库容和文库滴度均符合建库要求,用pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体筛选得到互作蛋白SlCCX1-like,为进一步研究在果实发育进程SlHSP17.7的生物学功能提供了保障。     

木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上,筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明,该基因在叶片特异表达,受干旱、低温负调控,同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,MeMYB60可以在保卫细胞表达,预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中,具有转录激活活性,其转录激活结构域在蛋白C端第194～343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸残基片段为诱饵,从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白,酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。     

稻瘟病菌NAD(H)激酶Mopos5互作蛋白的筛选

为了探索Mopos5可能参与的信号网络,了解其作用的分子机制,利用酵母双杂交系统筛选了稻瘟病菌cDNA文库,获得了6个与Mopos5互作的蛋白;结合生物信息学预测分析和相关文献报道,发现这些候选互作蛋白很可能参与调控了细胞骨架建成、细胞运动、细胞分裂、细胞老化与死亡、线粒体功能维持、胁迫防御反应、物质与能量代谢和信号传导等多种多样的生物学进程。进一步分析这些互作蛋白的生物学功能及与Mopos5的互作机制,对于了解Mopos5可能参与的信号网络及其调控稻瘟病菌在寄主组织内定殖和扩展的分子机制具有重要的意义。     

枣ZjERF53转录因子的转录激活分析及互作蛋白筛选

乙烯应答因子广泛参与调控植物生长发育和非生物胁迫响应过程。本研究克隆了1个在枣(Ziziphus jujuba Mill.)果实成熟后期高表达的ZjERF53转录因子,对其进行了亚细胞定位、转录激活活性和互作蛋白筛选研究,以揭示其生物学功能。研究结果表明：ZjERF53基因编码区序列全长为1 155 bp,能在细胞核和细胞膜中表达;ZjERF53具有自激活活性,其转录激活功能区域位于蛋白序列C端;以无自激活活性pGBKT7-ZjERF53-N为诱饵,通过酵母双杂交技术筛选枣果实cDNA文库,共获得4个互作蛋白。本研究揭示了ZjERF53可能参与枣树抗病和抗旱等非生物胁迫响应,为解析ERF参与调控枣树生物学过程的分子机制提供了工作基础。     

水稻酵母双杂交文库构建及PID2胞内结构域互作蛋白的筛选

为了进一步挖掘水稻PID2胞内互作蛋白质,阐明Pid2介导的稻瘟病抗性机制。本研究利用SMART技术,构建了受稻瘟病诱导后不同时间段的含抗性基因Pid2水稻材料的cDNA文库;通过PCR扩增获得PID2胞内结构域编码片段Pid2-JM,构建了诱饵表达载体pGBK-Pid2-JM,并进一步利用酵母双杂交技术筛选Pid2-JM的互作蛋白。结果表明,构建的cDNA酵母文库细胞密度为9.0×10⁷Cells/mL,文库插入片段在500～2 000 bp之间,重组率为100%,诱饵载体无自激活活性;利用诱饵载体经筛选文库后,新发现一个能与Pid2-JM互作的U-box类E3泛素连接酶PBP1,经回转试验验证了PBP1与Pid2-JM可在烟草细胞内互作。综上,本研究成功构建了稻瘟病诱导下的水稻酵母双杂交文库,并筛选到一个能与PID2胞内结构域互作的U-box类E3泛素连接酶,该结果为进一步揭示水稻抗稻瘟病信号转导机制提供参考。     

木薯MeSAUR1互作蛋白的筛选及鉴定

木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是淀粉合成关键酶AGPase的催化中心,前期研究发现MeSAUR1转录因子可结合MeAGPS1a基因启动子并调控该基因表达。采用酵母双杂交技术筛选MeSAUR1转录因子的互作蛋白,可进一步解析MeAGPS1a基因表达的分子调控网络。本研究构建了MeSAUR1的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-MeSAUR1,采用酵母双杂交技术从木薯cDNA文库中筛选MeSAUR1的候选互作蛋白,结果共筛选出31个阳性克隆。通过酵母双杂交点对点实验验证了候选互作蛋白MePP2C与MeSAUR1的互作关系,本研究结果有助于揭示Me SAUR1蛋白调控木薯淀粉合成的互作网络。     

日本结缕草ZjERF2转录激活验证及互作蛋白的初步筛选

为了研究ZjERF2转录因子在日本结缕草(Zoysia japonica)生长发育和环境胁迫中的调控通路,筛选与ZjERF2转录调控过程中互作的蛋白。本研究采用酵母双杂的方法,通过构建"诱饵"载体p GBKT7-ZjERF2,并转化酵母感受态细胞,表明"诱饵"载体在酵母细胞中无毒且不能自激活。将p GBKT7-ZjERF2和日本结缕草全长cDNA文库共转化酵母感受态细胞,经SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培养基筛选获得29个菌落,通过PCR扩增获得23个条带,进一步筛选到18个与ZjERF2互作的候选蛋白。对候选蛋白进行生物信息学分析,初步筛选到5个参与植物的生长发育、抗病原菌及环境胁迫调节的互作蛋白。本研究为探索Zj ERF2在植物生长发育和环境胁迫应答的调控机制提供帮助。     

Rubisco小亚基前体蛋白preSSU的互作蛋白分析

由核基因编码的叶绿体前体蛋白能否正确定向和转运到叶绿体，对叶绿体的功能十分重要。采用酵母双杂交方法，筛选豌豆的cDNA表达文库，分析检测与Rubisco小亚基前体蛋白（preSSU）相互作用并参与其调控的蛋白。结果表明，共有6种不同类型的蛋白与preSSU互作，分别为组氨酸蛋白激酶基因、转运蛋白复合体、转录和翻译相关蛋白及复合体、信号传导相关基因和光合合成相关基因。通过与相关蛋白的相互作用，preSSU也许参与了植物抗逆信号传导系统，并在植物的生长发育、成熟和衰老过程中起重要作用。     

拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22互作蛋白的筛选与分析

前期研究中从拟南芥突变体库中筛选获得一株对灰霉病菌侵染表现为感病的突变体。利用TAIL-PCR等技术克隆获得拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22。为了进一步明确T1N6_22在拟南芥抗灰霉病过程中的调控机制,利用酵母双杂交技术(Y2H),以构建成功的p AS1/T1N6_22蛋白为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库。通过酵母双杂交筛选,共获得28个酵母克隆。利用T1N6_2基因特异性引物鉴定酵母阳性克隆,并进行测序。共获得了4个可能与T1N6_22互作的蛋白AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400。Blast分析发现,AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400分别为核小体装配蛋白、功能未知蛋白、假定的泛酸还原酶和硫胺二磷酸盐结合折叠超家族蛋白,分别参与到核糖体装配、泛酸盐合成、植物代谢等过程中。研究结果为确定T1N6_22蛋白的互作蛋白,阐明其调控拟南芥抗灰霉病的分子机制奠定了基础。     

大豆(Glycine max) GmDREB5互作蛋白GmGβ1的筛选及鉴定

从大豆(Glycine max)中克隆了一个与抗逆相关的DREB (Dehydration Responsive Element Binding Protein) 基因GmDREB5。功能分析证明, GmDREB5基因能够显著提高烟草的抗旱性和耐盐性。为了筛选GmDREB5的互作蛋白, 采用酵母双杂交系统以GmDREB5蛋白73~226位氨基酸区段为诱饵筛选干旱处理的大豆cDNA文库, 发现一个互作蛋白含有保守的WD40结构域, 与棉花(Gossypium hirsutum)和水稻(Oryza sativa)的G蛋白β亚基分别具有61%和52%的同源性, 说明蛋白可能是一类新的大豆G蛋白β亚基, 将其定名为GmGβ1。将GmDREB5与GmGβ1共转化酵母菌株AH109, 转化的酵母能够在四营养缺陷型培养基上(SD/ trp- leu- his- ade-)正常生长, 而对照不能生长; 同时, 共转化的酵母能够激活LacZ报告基因的表达, 证明GmGβ1与GmDREB5之间存在相互作用。表达特性分析表明, GmGβ1基因受干旱、低温、高盐等胁迫和激素ABA处理的诱导而表达, 证明GmGβ1不仅参与植物对非生物胁迫的响应, 同时参与对GmDREB5蛋白水平的调控。     

利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦TaSC互作蛋白质

TaSC (Triticum asetivum L. salt-tolerance related gene, GenBank 登录号为AY956330)是从小麦耐盐突变体RH8706-49 中克隆的高盐诱导表达的耐盐相关基因。以该基因编码的蛋白质TaSC 为诱饵, 运用分裂泛素酵母双杂交技术从小麦cDNA 表达文库中钓取互作蛋白质, 筛选到一个编码小麦未知功能蛋白质的基因(GenBank 登录号为AK336035), 命名为TaSCIP1 (TaSC interaction protein 1)。双分子荧光互补(BiFC)实验证实TaSCIP1 与TaSC 存在互作。该互作蛋白的分离有利于进一步研究TaSC 基因的耐盐机制。     

油菜cDNA表达文库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选和鉴定

核盘菌 [Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary] 是引起油菜菌核病的病原真菌。核盘菌侵染植物细胞早期,可分泌一些细胞壁降解酶, 如不同类型的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)。这些酶对病菌在植物组织上的定植起关键作用, 同时酶活性的高低也决定病原菌的毒性或致病性。PG可以激活细胞的防卫反应而与其酶活性无关。为了解PG的信号转导途径, 利用RT-PCR方法克隆了核盘菌的PG基因, 将PG的编码区与酵母GAL4的DNA结合功能区融合, 构建到酵母诱饵蛋白表达载体PGBKT7中; 然后在酵母中构建了油菜cDNA表达文库。通过酵母双杂交方法在油菜cDNA表达文库中对与PG互作的蛋白进行了筛选, 分离到一个与PG互作的蛋白, 测序及BLAST分析表明该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域, 称为C2结构域(C2-domain), 推测该蛋白是一种钙依赖的膜结合蛋白。该蛋白与拟南芥中一个含C2结构域功能未知蛋白的氨基酸同源性高达80.24%。利用半定量PCR分析了核盘菌诱导后该基因在油菜花、茎、叶中的表达, 结果表明该基因在叶片中表达量最高。克隆到的C2蛋白与其他物种中的C2蛋白比较发现, 与钙离子结合的天冬氨酸残基很保守。     

海岛棉纤维发育相关基因GbPDF2酵母单杂交文库构建及其上游基因解析

为研究棉纤维起始发育的分子调控网络,以海岛棉(Gossypium barbadence L.)品种"海渝"开花当天(0 DPA)胚珠为实验材料,利用酵母单杂交技术来筛选棉纤维起始发育相关基因GbPDF2的上游调控转录因子。首先,克隆GbPDF2的启动子(Accession:KJ475468);构建了该启动子的诱饵融合载体(GbPDF2-PRO)-pAbAi,转入酵母细胞中重组为Y1HGold[Bait-pAbAi]菌株。之后,应用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System系统构建酵母单杂交cDNA文库,转化重组酵母菌株,通过同源重组筛选GbPDF2的上游转录调节因子。构建的cDNA文库库容为2.23×106,重组率为95.8%,插入片段大小为300 bp~2000 bp,其中大于1000bp的阳性克隆为109个。cDNA插入片段经测序和Blast同源性分析,筛选出2个生长素响应因子,1个WRKY7转录因子,1个WD-repeatprotein 40等与纤维发育相关的转录调节因子,为研究棉纤维起始发育的信号转导通路奠定了基础。     

油脂形成期棉花种子全长cDNA文库的构建

 提取海岛棉7124开花后25～35 d胚的总RNA,利用SMART技术,经21轮LD-PCR扩增获得全长双链cDNA,经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,收集500 bp以上的片段与pDNR-Lib载体连接并转化到感受态DH10B细胞,构建了棉花种子全长cDNA文库。所构建的原始文库库容为5×10⁶,文库滴度为1.5×10⁸ cfu·mL^-1。在文库中随机挑取180个克隆进行PCR检测,结果显示,文库中插入片段长度为0.5～2.5 kb,将挑取的180个单克隆进行EST测序,无空载序列,说明文库重组率为100%;序列分析结果表明,其中与油脂形成相关的EST有13条。以上数据说明构建的文库质量较高,为进一步从文库中分离棉花脂肪酸代谢关键基因,提高棉花含油量奠定了基础。     

小麦ERF转录因子W17互作蛋白的筛选和解析

来自小麦的ERF转录因子W17基因参与胁迫应答,过表达W17可显著提高转基因拟南芥的抗旱性和抗病性。本研究构建了小麦cDNA文库,通过酵母双杂技术筛选W17的互作蛋白,以期进一步解析ERF蛋白的作用机制。将pGBKT7-W17质粒、pGADT7和小麦文库混合转入酵母细胞AH109,在SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade营养缺陷型平板上培养,挑选直径大于2 mm的克隆,在SD/Raf/Gal/X-gal平板上划线培养,筛选蓝色克隆。将筛出的克隆测序、BLAST分析,得到4类与W17相互作用的候选蛋白,分别是胁迫相关功能蛋白、翻译后修饰蛋白、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亚基/小亚基以及功能未知蛋白。互作验证表明,Hsp90和PPR蛋白与W17有相互作用关系。这些候选蛋白参与信号转导或免疫过程,暗示W17在植物的逆境信号转导、下游基因转录调控,甚至在翻译过程都有重要作用。     

拟南芥AtCYS6基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因AtCYS6相互作用的蛋白,构建其酵母双杂交诱饵表达载体。本研究利用PCR方法扩增得到拟南芥AtCYS6的基因片段,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵表达载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过醋酸锂法将诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6与空载体pGBKT7分别转化到Y2HGold酵母菌株,检测其是否有自激活能力以及对宿主酵母菌株是否有毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了AtCYS6基因,成功构建了无自激活和没有毒性的诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6。本研究结果可进一步为筛选与AtCYS6相互作用的蛋白质及功能研究提供科学依据。     

甘蓝型油菜BnMAPK1的原核表达、亚细胞定位及酵母双杂交文库筛选

植物的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-ActivatedProteinKinases,MAPKs)级联是生长进程中多种信号跨膜传递的共同通路,它可以将外源刺激转入细胞内并引发细胞应答。目前C族MAPKs在甘蓝型油菜中的研究报道还很有限。本研究通过1个甘蓝型油菜的C族BnMAPK1基因的生物学进程聚类分析发现, BnMAPK1可能参与蛋白磷酸化、生长素介导的信号途径、逆境应答、细胞周期及转录等过程。BnMAPK1具有369个氨基酸残基,其相对分子质量约为42.5 kD,其可溶性蛋白可在原核系统中被诱导表达。BnMAPK1的亚细胞定位结果显示, BnMAPK1主要在细胞核内表达。Bait质粒pGBKT7-BnMAPK1在酵母双杂交系统中无毒性及自激活活性。为深入研究BnMAPK1蛋白参与的生物学进程,从甘蓝型油菜中油821苗期根、茎、叶中分别提取总RNA,分离得到mRNA,利用SMART技术合成并纯化双链cDNA后建立甘蓝型油菜混合cDNA文库。以共转化法筛选与BnMAPK1相互作用的蛋白,对其分析与鉴定显示, BnMAPK1在生长发育、非生物及生物逆境、转录、蛋白合成及代谢、翻译及翻译后修饰等过程中起作用。研究结果为MAPKs级联,尤其是C族MAPKs的研究提供了新的视野,为甘蓝型油菜抗性的机理研究及分子育种奠定了重要的理论依据。