亚麻糖基转移酶基因LuUGT72E1的克隆与表达分析

以亚麻茎部组织总RNA为模版,通过反转录PCR获得糖基转移酶Lu UGT72E1基因的全长开放读码框序列。序列分析结果表明:开放读码框全长1 476bp,共编码491个氨基酸。通过多氨基酸比对发现,该蛋白与亚麻UGT72N2蛋白亲缘关系最近,相似度达99%,与毛果杨、巨桉、木薯、雷蒙德氏棉及拟南芥UGT72E1蛋白的氨基酸序列相似性在58%~51%。分子进化分析表明,该蛋白与拟南芥UGT72E1~3聚为一类,推测该蛋白参与木质素单体的糖基化修饰过程。基因表达谱结果表明,该基因被BR、Brz诱导下调表达。本研究为亚麻的纤维品质改良提供了候选基因。     

蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因克隆与表达分析

为探讨蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)在蓖麻耐盐中的作用，以蓖麻叶片为材料，设计特异性引物，克隆蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29),并对所得序列进行生物信息学分析。结果表明，蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)序列全长1 590 bp;编码528个氨基酸；蛋白分子量为59.74 ku;等电点(pI)值6.21;是典型的非跨膜蛋白；亲水性数值为负值，属于亲水性蛋白；RcCDPK29蛋白α-螺旋占比最高有228个；RcCDPK29与拟南芥CDPK(SMTL ID:3q5i.1)相似度为40.41%,具有较高可信度(>30%)。将木薯、麻枫树、巴西橡胶树、柑橘、石榴、毛果杨与蓖麻RcCDPK29氨基酸序列进行同源性比对。其中，与麻枫树的同源性最高，为82.29%。RcCDPK29蛋白包含1个Ser/Thr蛋白激酶催化结构域和4个与Ca²⁺结合的EF-hand型结构域。通过qRT-PCR技术，分析RcCDPK29在不同水平盐胁迫下蓖麻不同组织中的表达，结果表明，RcCDPK29基因主要在茎中表达，盐处理12 h表达量最高。随着盐处...     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

红麻液泡膜质子泵H~+-PPase(Hcvp1)基因的克隆、序列分析和表达

为了阐明红麻耐盐机理,以耐盐性较强的中红麻16号为材料,从红麻耐盐转录组测序结果中获得了1个与AVP1基因高度相似的Unigene,根据该片段的序列设计引物,直接进行PCR扩增,经Sanger测序获得该基因全长c DNA序列。对该基因序列进行生物信息学分析表明:该基因全长2 298 bp,开放阅读框为2 298 bp,编码765个氨基酸,其编码蛋白质的分子量和等电点分别为80.2 k Da和5.25,与雷蒙德氏棉、甜橙、毛果杨、烟草和大豆的H+-PPase基因核苷酸序列的相似性分别为90%,85%,85%,83%,83%,蛋白质序列的相似性分别为96%,93%,91%,93%,94%,说明该基因与AVP1为同源基因,命名为Hcvp1。qRT-PCR分析表明,该基因的表达量随着Na Cl浓度的增加而增加。这将为Hcvp1基因的功能验证和红麻耐盐机理的研究奠定坚实的基础。     

草莓ABA结合蛋白基因的克隆及序列分析

为进一步研究ABA结合蛋白在草莓抗逆性方面的作用,本文通过CTAB法提取五叶草莓总DNA,根据NCBI数据库中的ABA结合蛋白受体的基因序列信息,设计特异引物,克隆得到4426 bp的ABA结合蛋白基因。序列分析表明该基因全长4662 bp,编码1393个氨基酸,核苷酸序列比对表明,该序列与GenBank中其他物种的CHLH序列有极高的同源性,核苷酸序列比较相似率在77%~90%,氨基酸相似性在63%~73%。     

玉米液泡ATP酶亚基A基因的克隆及表达分析

V-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用, 对其关键亚基基因的克隆及分析有助于阐释其在逆境下的调节及响应机制。本文利用RACE技术从玉米自交系CN165花期水分胁迫下的总RNA中克隆出液泡ATP酶亚基A基因, 命名为ZmVHA-A。该基因cDNA全长2 414 bp, 含5′-UTR(293 bp)、3′-UTR(257 bp)及编码区(1 863 bp), 编码620个氨基酸。序列比对及结构域预测结果表明, ZmVHA-A基因编码的氨基酸序列与亲缘关系比较接近的禾本科作物如水稻、小麦和大麦的氨基酸序列同源性分别达92.7%、89.8%和89.8%, 且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与核苷酸的磷酸基团相互作用的保守结构域“GAFGCGKT”和“PSVNWLISYS”, 可见该亚基是相对保守的。Northern杂交分析结果表明, ZmVHA-A基因在花丝中被水分胁迫诱导表达且在苗期对盐胁迫、冷处理和ABA处理具有不同的表达响应方式, 因此认为VHA-A基因是一个比较保守的功能亚基,并且通过转录表达调节参与了V-ATPase对逆境胁迫的适应。     

苎麻Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆和表达分析

以耐旱性较强的湘苎3号为材料,从苎麻转录组测序结果中获得了1个与P5CS基因高度相似的Unigene,该片段长1 448 bp,根据该序列设计5′RACE和3′RACE槽式PCR引物,利用RACE结合RT-PCR技术分别克隆得到590 bp的5′端和293 bp的3′端,拼接获得该基因全长cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析表明,该基因全长为2 318 bp,其中开放读码框为2 154 bp,编码717个氨基酸,其编码蛋白质的等电点和分子量分别为6.57 kD和77.56 kD,与亚洲棉、麻风树、拟南芥和水稻的P5CS基因的核苷酸序列相似性分别为81%、81%、75%和72%,蛋白质序列的相似性分别为86%、85%、78%和77%,说明该基因与P5CS为同源,被命名为BnP5CS1。半定量RT-PCR分析表明,该基因在苎麻的茎尖中表达量最高,在根中其次, 且受干旱胁迫的诱导。P5CS基因是植物体内合成脯氨酸的关键酶基因,BnP5CS1基因的克隆将为苎麻的抗逆分子育种和进一步的功能分析鉴定基础。     

西藏青稞LEA3蛋白新抗旱基因的克隆与序列分析

以强抗旱青稞冬青8号和弱抗旱青稞品比14为材料,将幼苗经干旱诱导处理12 h提取总RNA,RT-PCR同源克隆到2个有差异的LEA3蛋白抗旱基因的全编码框序列。冬青8号、品比14的LEA3蛋白基因序列全长分别为661 bp和694 bp,其中,来源于品比14的LEA3蛋白基因编码框全长639 bp,编码含213个氨基酸残基的蛋白质,该多肽含有9个重复的、由11个氨基酸残基组成的保守基元序列。而来源冬青8号的LEA3蛋白基因与之相比较除缺少33 bp核苷酸外,另有6个碱基的差异,所编码的蛋白质也相应地缺少第4个保守基元序列,由8个重复的保守基元序列组成。二者在DNA与氨基酸序列上的同源性分别为94.38%和92.02%。结果证实抗旱性不同的青稞品种之间LEA3抗旱蛋白保守基元拷贝数有差异,推测抗旱蛋白结构的差异可能对植物的抗旱性有影响。     

苎麻CCRs基因家族3类成员的生化特性与表达差异

肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是木质素生物合成的关键酶,在植物中多以基因家族形式存在。本研究通过苎麻转录组信息,筛选并克隆了4个苎麻CCR基因家族成员(BnCCR、BnCCR-1、BnCCR-2和BnCCR-3)。序列分析结果发现4个BnCCRs可以分为3类, BnCCR属于bona fide CCR类群, BnCCR-1为CCR类似蛋白,而BnCCR-2和BnCCR-3序列在NADPH结合功能域、催化三联体以及CCR底物结合位点上均与bonafideCCR都有差异,形成了苎麻中一个新的CCR类群。跨膜结构分析显示,BnCCR含有1个跨膜螺旋区,其他3个BnCCRse无跨膜螺旋区。结构分析显示,4个BnCCRs的二级和三级结构存在差异,BnCCR-2同源建模模板不同于其他3个BnCCRs。时空表达谱分析发现, BnCCR在快速生长期的木质部具有较高表达水平,而BnCCR-2在快速生长期的韧皮部具有非常高的表达水平。体外酶活测定进一步研究发现,BnCCR具有典型的bonafideCCR催化活性和底物适应性,而BnCCR-2的表现不同于典型CCR的底物适应性,对肉桂酰CoA和芥子酰CoA表现...     

苎麻COMT基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR法结合cDNA末端快速扩增（RACE）法从苎麻中克隆了与木质素合成相关的COMT基因的全长cDNA序列。所获得的COMT基因全长1318bp,包含一个开放阅读框1098bp,编码365个氨基酸。序列相似性检索结果表明,苎麻COMT全长cDNA与杨树COMT基因的序列同源性达82%,其编码的氨基酸序列与杏的COMT氨基酸序列同源性最高,达93%。同时还检索到该氨基酸序列包含一个O-甲基转移酶的保守结构。     

苎麻C3H基因的克隆、生物信息学分析及表达分析

旨在为后期验证C3H基因编码蛋白功能并最终实现低木质素优良苎麻品种的基因工程育种奠定基础。基于苎麻高通量测序信息,利用RACE技术克隆C3H基因全长序列,对其进行生物信息学分析;并利用荧光定量技术对苎麻C3H的表达模式进行研究。获得了全长为1940 bp的苎麻C3H基因c DNA序列Bn C3H-1(Gen Bank登录号为KY078743)。Bn C3H-1基因编码蛋白理化性质和结构的分析表明,该基因编码一个含511个氨基酸,分子量为57.80 k D的亲水性蛋白,它可能定位在内质网上。氨基酸序列和结构分析显示Bn C3H-1有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与巨桉和苦荞C3H基因具有很高的同源性。     

蕙兰TUB基因片段的克隆与序列分析

对蕙兰TUB基因片段进行克隆与序列分析,为蕙兰内参基因的筛选和研究其生理功能提供研究基础。根据NCBI已经公布的TUB基因的同源核苷酸保守序列,进行简并引物设计,利用RT-PCR的方法,以蕙兰花蕾期的花葶为材料,克隆了5条TUB基因片段。序列分析结果表明,5条TUB基因片段长度均为1055bp,编码351个氨基酸,具有2个TUB基因标记位点：Tubulin-betamRNAautoregulationsignal：MREI和Tubulinsubunitsalpha,beta,andgammasignature(GGGTGSG)特征信号序列。各片段之间同源性高达91.72%,经BLAST分析,与小麦的TUB1同源性可达85%。利用DNAMAN等生物软件推断的氨基酸,与毛果杨、蓖麻、葡萄同源性达97%。研究中得到的5个基因序列是TUB基因的同源片段,分别命名为CfTUB1、CfTUB2、CfTUB3、CfTUB4和CfTUB5,并在GenBank注册,登录号分为JN177713、JN177714、JN177715、JN177716和JN177717。     

MiR156 and its Target Gene TBCC in Flower Development of Gossypium harknessii Cytoplasmic Male Sterile Line and its Maintainer

This study aimed to analyze the expression level and relationship between miR156 and its target gene TBCC (Tubulin binding Cofactor C) in buds of Gossypium at different developmental stage in a cytoplasmic male sterile(CMS) line and its maintainer line, to clone the full-length cDNA of the TBCC gene, and to determine the possible role of the TBCC gene in pollen development. Real-time RT-PCR showed that the expression levels of miR156 gradually increased with the development of pollen between the CMS line and the maintainer line. The expression of GhTBCC was strikingly complementary with the expression of miR156 in the maintainer line, but showed very low expression levels in the CMS line, which demonstrated that TBCC is related to male sterility. The full-length cDNA sequence of TBCC was cloned from the buds of the maintainer line, and the gene was named as GhTBCC. The CDS of GhTBCC is 1713 bp and encodes a predicted protein of 570 amino acids with a predicted molecular weight of 62.79 kDa. Conserved TBCC and CARP domains were observed in the predicted protein sequence. GhTBCC showed 81 %, 80 %, and 77 % sequence similarity to the TBCC protein sequences of Populous trichocarpa, Ricinus communis, and Arabidopsis thaliana, respectively.     

主要麻类作物的ITS序列分析与系统进化

比较主要麻类作物和测序植物间的ITS序列,可明确它们间系统位置和进化关系。本研究采用PCR扩增和搜索Gen Bank数据库,获得32份麻类作物和11份测序作物的核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacers,ITS)序列,利用MEGE软件分析ITS长度、G+C含量与同源性百分比差异。结果表明,黄麻属、红麻属、苎麻属和亚麻属的ITS基本序列全长分别为963、939、658和686 bp;G+C含量分别为57.87%、58.03%、59.05%和53.75%。黄麻属变异区域集中在220~386 bp间,红麻属变异区域集中在2个区段(206~347 bp,599~713 bp),苎麻属ITS变异区域分布在4个区段(158~163 bp、193~199 bp、288~333 bp和681~688 bp),亚麻属ITS变异区域分布在5个区段(219~229bp、235~240 bp、427~432 bp、468~484 bp和588~594 bp)。系统位置分析表明,红麻属与棉花亲缘关系最近,黄麻与棉花亲缘关系较近;亚麻与苎麻各为一小支。系统位置分析与传统的植物分类结果较一致。研究主要麻类作物比较基因组学时,红麻、黄麻可参考棉花,苎麻可参考杨树或蓖麻。推测红麻属的进化时间约为33.7百万年前(million years ago,MYA),黄麻属约为65.3MYA,苎麻属约为67.5MYA,亚麻属约为90.5MYA。主要麻类作物进化时间越久,同属不同种之间ITS变异区段越多。     

苎麻Actinl基因克隆及其在韧皮部纤维不同发育阶段的表达

通过cDNA文库的PCR筛选法获得苎麻内源肌动蛋白基因片段,采用苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaud]中苎1号为材料,结合RACE技术获得了苎麻的Actin1蛋白编码基因(BnACTIN1)的cDNA全长序列(GenBank登录号为DQ665832,2009年8月1日公布), 该基因全长cDNA序列1 782 bp,编码区长1 134 bp,编码377个氨基酸残基。Blastn分析表明,BnACTIN1基因与桑树(Morus alba: DQ785808)、蓖麻子(Ricinus communis: AY360221)、棉花(Gossypium hirsutum: AY305723-305736)等植物的肌动蛋白基因序列有高度的同源性。对推导的氨基酸序列进行分子进化分析表明,该基因与棉花Actin蛋白家族AAP73451.1、AAP73457.1聚为一类,三者之间的亲源关系最近。建立荧光定量PCR体系,用18S rRNA和Histone3内参基因对表达水平均一化,分析BnACTIN1基因在苎麻纤维细胞伸长过程中的表达水平变化。结果表明,在株高97 cm时最高,约为株高11、150和220 cm时表达量的230倍以上,是株高47 cm时期的20倍。本研究揭示的所获得BnACTIN1序列为苎麻的Actin1蛋白编码基因,其最高表达时期开始于纤维快速伸长时期,但稍早于纤维发育的高峰期,推测该基因可能与韧皮部纤维伸长过程中的肌细胞骨架形成有关。     

毛白杨细胞色素C还原酶的基因克隆、表达和亚细胞定位

为克隆得到毛白杨CPR基因、成功在体外表达可溶性蛋白并通过构建GFP偶联载体观察其亚细胞定位,本研究通过RT-PCR的方法克隆得到了毛白杨CPR基因,登录号为MK575137。进一步通过生物信息学分析,发现毛白杨CPR与毛果杨CPR同源性最高,均有着典型的细胞色素C还原酶结构域。随后在酵母表达体系中表达该蛋白,验证了该蛋白不能被分泌表达,表明CPR蛋白为膜蛋白。进一步的亚细胞定位实验表明,CPR蛋白定位于内质网。CPR蛋白是P450单加氧化酶催化木质素合成的相关过程中必不可少的辅酶,该研究可为今后体外验证毛白杨P450单加氧化酶在木质素合成的相关过程中的酶活活性提供基础。     

甘薯肌醇-1-磷酸合酶基因的表达分析

采用RT-PCR技术克隆了甘薯肌醇-1-磷酸合酶基因的cDNA编码区,命名为IbMIPS-1.该基因由1 530个碱基组成,编码510个氨基酸,与蓖麻、烟草、芝麻、大豆肌醇-1-磷酸合酶的氨基酸序列比对表明,其同源性很高.将克隆的IbMIPS-1基因连接到pQE30载体,构建原核表达载体.实时定量RT-PCR分析结果表明,在茎线虫侵染甘薯块根后,IbMIPS-1基因被诱导表达,并且在侵染后的第4天表达量最高.推测该基因可能参与甘薯抗茎线虫病信号传导,以诱发甘薯茎线虫病抗性反应.     

巴西橡胶树HbUBC22基因克隆与表达分析

泛素蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway, UPP）是细胞内最重要的且具有高度选择性的蛋白质降解途径,而泛素结合酶E2/UBC是该途径的一个关键酶。本研究通过对巴西橡胶树同源EST序列拼接和RT-PCR扩增的方法,克隆了一个巴西橡胶树的泛素结合酶基因HbUBC22,该基因的开放阅读框（ORF）共807 bp,编码268个氨基酸,编码蛋白含有一个保守的UBC结构域和一个高度保守的半胱氨酸催化位点。系统进化关系分析发现,HbUBC22蛋白与蓖麻、杨树、油茶和葡萄的UBC蛋白的同源性最高,分别为89%、85%、85%和81%;在拟南芥基因组中,HbUBC22则与AtUBC22的同源性最高达到73%。表达谱分析结果显示,HbUBC22受乙烯利和茉莉酸甲酯诱导显著上调表达。原核表达分析结果表明,经IPTG诱导后,HbUBC22能够在大肠杆菌中表达出目标蛋白。本研究结果为进一步研究HbUBC22在橡胶树中的生物学功能奠定了良好基础。     

木薯AGPase基因的克隆与载体构建

为了研究木薯淀粉合成酶关键基因AGPase在木薯淀粉合成中的作用,根据GenBank中其他物种AGPase小亚基基因序列,从高淀粉木薯‘辐选01’中克隆得到含3’末端的909 bp的基因片段,回收克隆测序。结果显示,克隆获得片段与基因库中登录的蓖麻、毛果杨、甜橙、番薯、蜜柑、大豆同源性依次达到91%、91%、87%、86%、86%及85%。将阳性克隆与PBI121载体进行双酶切、连接,构建植物反义表达载体PBI121-AGPss,并将其导入农杆菌,得到农杆菌工程菌株。为进一步开展木薯淀粉合成相关的基因调控、转基因及基因功能研究奠定基础。     

苎麻果胶合成重要酶UGlcAE基因的克隆及组织表达

以苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaud]中苎1号为材料,采用简并RT-PCR法、RACE技术以及全长cDNA文库筛选,克隆苎麻果胶主要多糖组分的合成关键酶UGlcAE cDNA序列,序列长度为1 257 bp,编码区长723 bp,可编码241个氨基酸序列。实时定量PCR证实,UGlcAE表达量为根部＞叶片＞韧皮部＞木质部,在根部的表达量占优势。该结果对我们后期采用分子生物学方法来调控果胶的合成量具有实际意义。