果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(CsPG1)的克隆及功能分析

多聚半乳糖醛酸酶(Polygalactuionasem, PG)是一种细胞壁结构蛋白,可以催化果胶分子多聚α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解,使细胞壁结构解体,导致果实软化。本文采用qRT-PCR方法,分析不同生长阶段菌丝侵染的油菜叶片中多聚半乳糖醛酸酶基因的表达模式。结果表明：(1)采用RT-PCR从果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana)菌核中扩增多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA,其全长为1143 bp,命名为CsPG1 (GenBank登录号为KR296662),编码380个氨基酸残,根据侵染油菜叶片的表达量,确认CsPG为基因家族的主效基因;(2)将CsPG1基因连接pET28a(+)载体并转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3),获得包涵体形式,但对底物(聚半乳糖醛酸)没有活性的蛋白;(3)最适CsPG1包涵体溶解的尿素浓度6 mol L^–1,采用缓慢稀释低温复性的方法对重组蛋白CsPG1进行了重折叠复性试验,经高亲和力的Ni-NTA树脂纯化后为得到单一条带,获得可溶性蛋白,复性后的多聚半乳糖醛酸酶比活力为5.02 U mg^–1;(4)生物试验表明,CsPG1蛋白能够加速嘉陵40 (Morus atropurpurea Roxb.)桑椹的成熟和软化,推测该蛋白与肥大性菌核病菌对桑椹的侵染有关。这一结果揭示了不同果桑品种对菌核病敏感性的差异,为果桑生产中菌核病的防控提供了分子证据.     

两个烟草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆和表达分析

为了研究多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)在烟草中的生物学功能,运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到2个多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因c DNA和DNA全长序列,分别命名为Nt PGIP1(Gen Bank登录号:KF317203)和Nt PGIP2(Gen Bank登录号:KF317204)。Nt PGIP1基因全长为1 413 bp,编码338个氨基酸;Nt PGIP2基因全长为1 185 bp,编码329个氨基酸;两基因均没有内含子序列,核苷酸序列有50%的一致性,编码的氨基酸序列有54%的一致性。两基因编码蛋白均含有植物PGIP蛋白特有的重复保守序列LXXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX。对PGIP基因在烟草不同组织表达量分析发现,两基因在根、茎、叶和芽中均有表达,其中均在茎中表达量最高,其次是根,叶中表达量很低。     

草原樱桃PGIP基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆草原樱桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因,并进行生物信息学分析。以草原樱桃叶片基因组为模板,PGIP基因保守序列设计引物,通过PCR扩增获得约1 kb的DNA片段。序列分析表明,该基因全长1 193 bp,包含有1个完整的开放阅读框,由2个外显子和1个内含子构成,外显子总长990 bp,编码330个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列,GenBank登录号为GU068977;该基因与中国李、杏、桃、马哈利樱桃、梅等李属植物的PGIP基因序列一致度达95%～99%。系统进化分析显示,属内亲缘关系较近、属间亲缘关系较远的特点。克隆了草原樱桃PGIP基因,为樱桃抗病育种提供一条新的基因资源。     

1-MCP对外源乙烯诱导油桃果实软化的影响

以秦光油桃为试材,研究了1-MCP处理对外源乙烯诱导果实软化的影响.结果表明,1-MCP处理可抑制外源乙烯诱导果实硬度的下降,将乙烯诱导果实的淀粉、纤维素和果胶类物质的降解延迟2天,对引起这些物质降解的相关酶类如淀粉酶、纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶(PG)等酶活性高峰的到来推迟2天,同时降低了多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性高峰值.     

苹果PGIP基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究

为了验证苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因表达产物对植物病原真菌的作用,获得转基因植株,培育抗病新品种,本研究用限制性内切酶SalⅠ、BamHⅠ将已克隆的苹果PGIP基因从克隆载体pMD-18T上切下,定向插入到植物表达载体pWR306的ED35s启动子和TNOS终止子中间,成功构建了苹果PGIP基因植物表达载体pWR306-PGIP及工程农杆菌,以番茄中蔬四号叶片及茎段为受体,通过农杆菌介导法转化,获得了8株PCR检测阳性的番茄植株.     

棉花育性相关基因GhPG2的克隆与表达分析

多聚半乳糖醛酸酶家族是一个细胞壁水解酶,在许多高等植物的花粉中都具有高水平外切多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性,可能在花粉成熟和花粉管伸长中发挥重要作用。利用已报道与恢复基因连锁的分子标记STS679筛选陆地棉Y18恢复系核基因组BAC文库,获得一个阳性克隆Z55E7,对该克隆测序获得6个基因,其中一个为编码多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)基因,暂被命名为GhPG2。在棉花细胞质雄性不育系、保持系和恢复系中对该基因进行序列和表达分析,以便进一步了解该基因与棉花细胞质雄性不育的关系。从BAC克隆中分离到GhPG2基因,对其进行序列分析,以半定量RT-PCR和实时定量PCR分析该GhPG2基因在棉花恢复系、保持系和不育系各个组织中的表达模式。分离到GhPG2基因的基因组序列为1 518 bp,其开放阅读框序列为1 239 bp,共编码412个氨基酸,包含PG基因家族的4个保守结构域。系统进化树分析表明,GhPG2基因与其他物种花粉表达的PG基因同属C分支。表达分析表明, 该基因在恢复系和保持系的花药、花瓣和VI级花蕾中高表达,而不育系的相应组织该基因表达量明显降低。GhPG2基因归类于花粉表达的一类PG基因。实验结果暗示GhPG2基因可能与棉花正常的花器官发育相关。     

新病害草莓褐色叶斑病病原菌细胞壁降解酶研究

草莓褐色叶斑病是中国新发现的一种病害,造成叶片坏死和果实腐烂。为明确该病原菌的致病机理,对草莓褐色叶斑病菌产生的细胞壁降解酶进行研究。采用3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）和紫外分光光度计法测定该病原菌产生的细胞壁降解酶的种类和活性。结果发现,该病原菌能够产生多种细胞壁降解酶,即多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)和果胶甲基反式消除酶(PMTE),但不产生纤维素酶(Cx),其中PG和PMG活性较强,且PG和PMG在培养6天时活性最强,PMG在23℃条件下培养时活性最强,PG在28℃条件下培养时活性最强,静止和振荡交替培养有利于PG和PMG的产生。致病作用研究发现,果胶酶（PG和PMG）可引起果实腐烂和叶片坏死,说明其在该病原菌的致病过程中起重要作用。     

枣多聚半乳糖醛酸酶基因家族的鉴定及表达分析

多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因家族是细胞壁水解酶大家族,为了探究其在枣果发育过程中的作用,本研究通过生物信息学方法对‘冬枣’基因组进行了分析,共鉴定到41个ZjPG基因,编码263～845个氨基酸,不均匀地分布在除7号染色体外的其他染色体上,其中36个ZjPG蛋白具有完整的保守结构域。系统发育分析将ZjPG家族成员划分为6个分枝。对枣PG基因表达模式分析,发现部分基因在果实发育后期表达较高,这可能暗示着这些基因在果实发育相应阶段起到重要作用。本研究为枣PG基因各成员的功能分析提供了基础。     

三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的功能分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是植物抗病防御系统的重要组成部分。在前期研究中,从三七中分离得到一个编码PGIP蛋白的基因PnPGIP,PnPGIP在转录水平响应三七根腐病菌茄腐镰刀菌的侵染。为深入分析PnPGIP的功能,构建PnPGIP的原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行大量表达,纯化获得PnPGIP的重组蛋白,并进行体外平板抑菌试验;构建PnPGIP的植物超表达载体,通过根癌农杆菌介导产生了PnPGIP转基因烟草,分析T2转基因烟草离体叶片对茄腐镰刀菌的抗性。PnPGIP原核重组蛋白对茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌、核盘菌和轮枝状镰刀菌的菌丝生长具有很强的抑制作用,并且随着蛋白量的增加,抑制活性也逐渐增强。q RT-PCR分析结果显示,PnPGIP在T2转基因烟草中大量表达。此外,与野生型烟草相比,转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性显著增强。PnPGIP是三七中参与茄腐镰刀菌防御反应的重要抗病基因。     

抗全蚀病、根腐病的转PgPGIP1基因小麦的获得与鉴定

全蚀病和根腐病是小麦(Triticum aestivum)重要的土传真菌病害。PgPGIP1是人参(Panax ginseng)的一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白,可以抑制部分病原真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶的活性。本研究人工合成了PgPGIP1基因,并构建PgPGIP1基因的单子叶植物表达载体pA25-PgPGIP1,通过基因枪介导法将其转入小麦品种扬麦18中。对转PgPGIP1基因的T₀至T₄代植株进行PCR、RT-PCR和Q-RT-PCR分析,并对其全蚀病和根腐病抗性进行鉴定。结果表明,PgPGIP1基因能够在4个转基因小麦株系中遗传、转录与表达。与未转基因的小麦扬麦18相比,4个转基因小麦株系对全蚀病与根腐病的抗性明显提高,说明PgPGIP1表达增强了转基因小麦对全蚀病与根腐病的抗性。     

巴西橡胶树K+通道蛋白HbKCO1的原核表达

K+通道蛋白在维持细胞离子平衡等生命活动中发挥重要的作用。利用真核或原核表达系统高效表达K+通道蛋白是深入研究其生化特征及生理功能的基础和前提。本研究在成功克隆巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)K+通道蛋白基因cDNA全长的基础上,将HbKCO1 cDNA 编码区插入pET-28a构建原核表达载体pET-28a(+)-HbKCO1,并分别转化大肠杆菌RosettaTM(DE3) pLysS和BL21(DE3)菌株。经过条件优化,转化的大肠杆菌RosettaTM(DE3) pLysS菌株经1mM IPTG诱导3h能够高效表达HbKCO1重组蛋白,但同等条件下转化的BL21(DE3)菌株仅能微量表达。HbKCO1重组蛋白原核表达具有菌株依赖性。     

樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达

为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。     

棉花去泛素化酶基因GhOTUD5原核表达条件的优化

棉花组蛋白去泛素化酶GhOTUD5与生殖发育密切相关。为了获得大量可溶性表达的GhOTUD5蛋白,本试验对目的蛋白原核表达条件进行优化。采用分子克隆方法构建重组表达载体pET-22b-GhOTUD5,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和Transetta(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导目的蛋白表达。在对影响原核表达的四个单因素(菌体密度OD600,诱导剂IPTG终浓度,诱导时间和诱导温度)分别分析的基础上,设计三水平的正交试验L9(43),摸索大量可溶性目的蛋白表达的最优条件。结果显示,目的蛋白GhOTUD5在Transetta(DE3)中成功表达,在BL21(DE3)中不表达。在菌体密度OD600为0.8、诱导温度为28℃、IPTG终浓度为0.7 mmol/L、诱导3 h的条件下可溶性目的蛋白表达量最高,达到13%左右。该研究结果为进一步研究GhOTUD5在棉花育性方面的功能提供了科学数据。     

Bacillus subtilis FS321的α-淀粉酶基因的克隆与表达

耐热α-淀粉酶被广泛用于食品等诸多行业,本研究从中国北方高温堆肥分离的枯草芽孢杆菌FS321中克隆了一中度耐热α-淀粉酶基因,并实现在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达。通过PCR技术克隆Bacillus subtilis FS321的α-淀粉酶编码基因(BSA),该基因全长1980 bp。并构建重组表达质粒pET-28a/BSA,转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测到大小约为73.0 kDa的重组融合蛋白,可溶性淀粉平板检测结果表明BSA在大肠杆菌中实现了有效表达。该重组α-淀粉酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为7.5。     

盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因DsSTPK的克隆、原核表达及纯化

前期研究表明,盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶DsSTPK在转录水平上的表达受盐胁迫诱导。为了进一步研究该蛋白激酶的生理功能,通过RT-PCR扩增DsSTPK的开放阅读框,并将其克隆至pET32a(+)载体,得到重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK。将重组表达载体转化E. coli. BL21 (DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用His60 Ni离子重力柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。本研究成功构建了重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK,经IPTG诱导后表达出的融合蛋白的分子量与预期相符;表达形式分析显示该融合蛋白在上清和包涵体中均存在;将上清蛋白纯化后获得了纯度较高的融合蛋白;Western-blot检测显示该融合蛋白能被抗组氨酸抗体特异性识别,具有良好的免疫学活性。DsSTPK的成功表达、纯化,为下一步制备抗体,然后进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。     

杜氏盐藻MAPKK激酶基因DsMAPKKK的克隆、原核表达与纯化

为了进一步研究MAPKK激酶的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了DsMAPKKK的开放阅读框序列,并利用T4连接酶与质粒pGS21a连接,构建了原核表达载体pGS21a-DsMAPKKK。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导成功表达了融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在上清和包涵体中均存在。可溶性蛋白经过GST柱纯化,电泳分析结果表明,在68kD左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在68kD左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白就是带有GST标签的MAPKK激酶。DsMAPKKK的成功表达与纯化,为深入探讨DsMAPKK激酶的性质及功能打下了坚实的基础。     

鸡新城疫病毒La Sota株F基因克隆及原核表达

参照NDVLa Sota株核酸序列(AF077761)设计1对引物,利用RT-PCR扩增F基因并得到了长为1 700 bp的片段,将其克隆到pGEM-T easy vector中,经酶切鉴定和测序后克隆进原核表达载体pET-32a,将重组表达质粒转化BL21(DE3),在IPTG诱导下表达约83 kd的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blotting检测证实该基因片段获得高效表达且表达产物具有免疫学活性。     

鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达

为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。     

一个受黄萎病菌诱导的海岛棉功能基因GbVWR的克隆与表达

黄萎病是一种土传真菌维管束病害,严重影响棉花产量和品质。挖掘抗黄萎病相关基因对于棉花抗黄萎病遗传改良具有重要意义。本研究通过筛选黄萎病菌胁迫下的海岛棉全长cDNA文库和陆地棉SSH文库,获得一个与黄萎病菌胁迫相关的基因,命名为GbVWR。生物信息学特征和基因表达分析表明,GbVWR基因全长520 bp,开放读码框198 bp,编码65个氨基酸残基组成的蛋白,理论等电点为5.32,包含一个信号肽和一个跨膜区,是一种分泌蛋白。GbVWR基因可以诱导表达7 kD的蛋白。在GbVWR基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到真菌激发子响应、激素响应、伤口响应及黄酮生物合成基因调节等应答元件。GbVWR基因在海岛棉根中表达最高,茎中其次,叶中最低。受黄萎病菌诱导后,GbVWR基因在接菌后2 h可对黄萎病菌作出应答反应。此外SA、ET和GA均可显著诱导GbVWR基因的表达。初步推断GbVWR是海岛棉抵御黄萎病菌过程中一个新的功能基因,通过参与多种激素信号途径发挥功能