大肠杆菌K88纤毛抗原的提纯和抗血清的制备

以5％绵羊血改良Minca琼脂筛选和克隆表达良好的K88^＋菌株，改良Minca琼脂培养获得K88菌液。用加热法及高速匀浆法使K88纤毛从菌体上脱下。饱和硫酸铵沉淀粗提，用Sepharose CL-4B凝胶过滤纯化K88抗原。提纯的抗原经SDS—PAGE电泳测定其分子量约为25000，且仅此一条蛋白带；与K88抗血清进行琼脂扩散试验只出现一条沉淀线。用提纯的抗原经多次免疫家兔制备了K88抗血清。抗血清在玻板凝集试验中只凝集K88菌株，不凝集K99，987P或F41菌株；在琼扩试验中，只与K88粗提抗原出现一条沉淀线，且效价为1：64，而不与K99，987P抗原出现沉淀线；在免疫电泳试验中，与无细胞K88纤毛液只出现一条沉淀线。鉴定结果表明，所制备的K88血清特异性强、效价高，可作为单因子血清用于凝集试验、琼扩试验等血清学试验，对K88菌株进行鉴定，对K88纤毛抗原进行定性和定量检测。     

猪链球菌35个血清型标准抗血清的制备及应用

用猪链球菌35个血清型的标准菌株免疫新西兰白兔制备标准抗血清,经试管凝集测定抗血清的效价均在1:32以上,吸附处理后抗血清具有良好的特异性和敏感性。对12株猪链球菌的试验结果表明:抗血清只与相同血清型的菌株出现凝集,可以区分出PCR方法无法区分的1型和14型以及2型和1/2型,并在国内首次鉴定出猪链球菌13型。     

鹅卵黄IgG的纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备

采用三氯甲烷去脂、无水Na2S04盐析、DEAE23纤维素层析相结合的方法纯化鹅卵黄IgG,SDS-PAGE检测表明,所得鹅卵黄IgG纯度可达93%;用纯化的IgG免疫家兔,抗血清经双向琼脂扩散,证明兔抗鹅IgG抗血清效价约1:64,免疫电泳试验检测,证明得到了特异性抗血清,提取兔抗血清的IgG,用辣根过氧化物酶标记,制备了兔抗鹅IgG的酶标抗体,酶标抗体的效价为1:6400.     

制备抗免疫球蛋白的特异血清

从出生后第一天开始,不同年龄动物血清免疫球蛋白种类的数量关系是生物体在不同发育阶段或在各种病理状态下免疫生物学性状的指标。测定免疫球蛋白IgG、IgM、IgA,主要是应用同类特异性血清。本实验目的是改善分离纯净免疫球蛋白和制备相应抗血清的方法。为了分离单一种类的免疫球蛋白,采用下述的物理一化学方法:用硫酸钠沉淀血清中球蛋白;用分子量为6000的聚乙二醇(—6000)沉淀方法,初步分离出单一的免疫球蛋白;用免疫电泳法测定已分离的免疫球蛋白纯度,用免疫扩散试验鉴定所制备的抗血清特异性;用家兔同类特异性抗血清     

磺胺甲恶唑人工抗原的合成与鉴定

为检测磺胺甲恶唑(SMZ)的残留,用重氮化方法将SMZ偶联于载体蛋白BSA和OVA上,合成了免疫抗原BSA-SMZ和包被抗原OVA-SMZ。经紫外扫描、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清;利用间接ELISA法测定多抗血清效价,竞争ELISA测定多抗血清的敏感性和特异性。结果表明,所合成的免疫抗原效果较好,6只免疫小鼠多抗血清的效价均大于1∶1.28×104,5号小鼠的多抗血清敏感性最高,半数抑制浓度为47.1ng/mL,与其他磺胺类药物无交叉反应,具备良好的特异性。试验成功合成了SMZ人工抗原,并制得了敏感性高、特异性好的鼠源多抗血清,为SMZ单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

猪鼻支原体抗血清的制备与鉴定

猪鼻支原体(Mycoplasma hyrhinis,Mhr)是猪鼻腔的常在菌。将猪鼻支原体与弗氏佐剂共乳化,免疫新西兰大白兔,获得猪鼻支原体兔抗血清。Western blotting检测其特异性;建立间接ELISA方法检测其抗体效价;将获得的猪鼻支原体兔抗血清分别加入猪鼻支原体和猪肺炎支原体培养物中,进行生长抑制试验。结果显示,制备的猪鼻支原体兔抗血清与猪鼻支原体具有反应原性;抗体效价达1:160 000以上;猪鼻支原体兔抗血清可以显著抑制猪鼻支原体的生长,而对猪肺炎支原体的生长影响较小。本试验结果为鉴定和检测猪鼻支原体提供了方法,也为猪肺炎支原体的分离提供了参考。     

鸡STARD3胞外域的原核表达及其抗血清制备

为获得鸡类固醇激素合成急性调节蛋白结构域3(STARD3)胞外域融合蛋白的特异性抗血清,采用人工合成方法获得鸡STARD3胞外域基因,利用pGEX6P-1质粒及BL21(DE3)进行原核表达,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,利用Western blot及间接ELISA方法测定抗体特异性和效价。结果显示:获得了STARD3胞外域融合蛋白的特异性抗血清,效价大于1∶6 400。本试验为研究鸡STARD3蛋白功能奠定了基础。     

己烯雌酚完全抗原的合成和多克隆抗体的制备

采用混合酸酐法,将己烯雌酚与牛血清白蛋白或卵清蛋白偶联形成完全抗原.经紫外分光光度计扫描鉴定,并通过聚丙烯酰胺电泳实验,推算出牛血清白蛋白与DES-HS的结合比是1:25～1:30.以己烯雌酚-牛血清白蛋白为抗原免疫家兔,制备出多克隆抗体,经酶联免疫吸附试验和琼脂扩散试验进行鉴定,并采用酶联免疫吸附方法进行效价测定,抗血清效价均超过了1:10 000.     

鸡血清载脂蛋白AⅠ的分离纯化及其抗血清的制备

用磷钨酸沉淀制备鸡血清HDL，乙醇-丙酮混合液(体积比为1：1)脱脂后采用DEAE Sepharose CL-6B离子交换柱层析法分离鸡血清apoAⅠ，分离获得的apoAⅠ在尿素-SDS-PAGE电泳中呈现单一条带，其分子质量约为27788u。将提取的apoAⅠ对新西兰雄兔进行多次免疫，制备得兔抗鸡apoAⅠ抗血清，其效价为1：16。在免疫电泳和双向免疫扩散试验中抗血清均只呈现1条清晰沉淀带。试验结果表明，用磷钨酸沉淀法制备兔抗鸡apoAⅠ抗血清，过程简便，时间短且分离效果好。     

氟苯尼考琥珀酸钠抗原的制备与鉴定

为获得效价高、特异性好的氟苯尼考的小鼠多抗血清,建立氟苯尼考的免疫学检测方法。选用氟苯尼考琥珀酸钠为靶标,用活化酯法将其分别与牛血清蛋白(albumin from bovine serum,BSA)和卵清蛋白(ovalbumin,OVA)进行偶联,制备F-S-Na-BSA人工免疫原和F-S-Na-OVA包被原,并用紫外扫描(UV)和SDS-PAGE法鉴定。用50μg/只剂量免疫8周龄的BALB/c小白鼠,制备小鼠多抗血清(pAb),用间接ELISA测定多抗血清(pAb)的效价和特异性。结果:220~350 nm内,F-S-Na-BSA和F-S-Na及BSA的最大吸收峰发生了位移;在SDS-PAGE凝胶电泳中,F-S-Na-BSA的迁移量比BSA略小,与预期的结果相符合。免疫的63只小鼠效价均达到1∶6 400以上;效价最高的1号小鼠IC_(50)≈10μg/m L。结论:F-S-Na-BSA偶联成功,注射小鼠获得了良好的免疫效果,但该多抗血清特异性较差。     

鸭抗鹅细小病毒抗血清的制备

为了研究鸭抗鹅细小病毒抗血清对鹅细小病毒病的防治效果,试验采用鹅细小病毒98E株鹅胚胚毒(活毒)免疫成年鸭,检测其抗体效价和并描绘抗体消长规律,利用琼扩效价为1∶32的鸭抗鹅细小病毒抗血清进行鹅细小病毒病预防和治疗试验。结果表明:首免第1周即可在血清中检测到抗体,加强免疫后第1周血清抗体琼扩效价即达到1∶128;攻毒后第25天,在预防试验中雏鹅死亡率为0,在治疗试验中雏鹅死亡率为56%。说明鸭抗鹅细小病毒抗血清对雏鹅细小病毒病的防治具有很好的效果。     

抗腹泻性贝毒软海绵酸多克隆抗体的制备与检测

制备了腹泻性贝毒软海绵酸(okadaic acid,0A)的多克隆抗体,鉴定了抗体特性.利用半抗原BSA偶联小分子毒素OA,制备完全抗原OA-BSA,免疫两只新西兰白兔,分离、纯化抗血清.用间接ELISA方法测定抗体效价,两个兔抗血清效价均达到128,000以上.IC50为2.852 ng/mL.DOT BLOT测定抗体特异性,结果表明,抗体与抗原有特异性反应.试验表明,抗OA多克隆抗体制备成功,其质量较好,可用于将来的免疫检测研究.     

鸭疫里默氏菌6型、12型与16型之间的交叉反应

鸭疫里默氏菌6型和12型仅在玻片凝集试验中存在较弱的交叉反应，这一交叉反应可经血清吸收试验得到消除；12型和16型在玻片凝集试验和试管凝集试验中均表现较强的双向交叉反应，但在琼扩试验中表现为较弱的单向交叉反应；6型和16型之间没有交叉反应。12型和16型之间的交叉反应和交叉沉淀反应均可经血清吸收后得以消除，但经过16型参考菌株吸收过的12型抗血清，还与6型菌株存在交叉凝集反应，只有同时用6型和16型菌株吸收，12型抗血清才具有血清型特异性。血清吸收对6型和12型抗血清的同型凝集反应能力和沉淀反应能力没有影响，但对16型抗血清的同源凝集能力和沉淀反应能力均有较大的影响，经、2型参考菌株吸收后，16型抗血清与同型抗原之间的凝集效价下降2个滴度，而且不再形成清晰的沉淀线。结果表明，6型和12型之间、12型和16型之间均存在ab-bc的抗原关系。     

氟喹诺酮类药物多组份残留的酶免疫分析法

采用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯法制备诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星和沙拉沙星完全抗原,经紫外光谱扫描鉴定后,免疫小鼠,ELISA测定抗体交叉反应性,筛选簇特异性抗体,建立多组份ciELISA检测方法.紫外光谱扫描结果证实4种半抗原与载体蛋白发生共价结合,所制备的沙拉沙星与诺氟沙星抗血清效价都在1:64 000以上,环丙沙星和达氟沙星抗血清效价都在1 :32 000以上.交叉反应率测定结果表明,沙拉沙星抗血清对沙拉沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的交叉反应率依次为100.00%、92.68%、89.12%和83.56%;利用沙拉沙星抗血清建立了针对上述4种药物的多组份ciELISA检测方法,最低检测限依次为19.3、34.5、31.3、29.2 μg/L,大于5μg/L水平的添加回收率均大于83%.     

针对不同形式猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白的抗体中和活性比较

GP5蛋白被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导中和抗体的主要蛋白,为探讨GP5蛋白诱导免疫保护的能力,本研究用杆状病毒/昆虫表达系统分别表达了全长和截短的GP5蛋白,同时用大肠杆菌表达系统表达了截短的GP5蛋白。三种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,以PRRSV全病毒作为ELISA包被抗原检测抗血清时,原核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶200,真核表达的全长GP5蛋白抗血清效价为1∶800,真核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶1 600。将获得的三种抗血清分别在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)进行PRRSV同源(PRRSV VR2332)和异源(PRRSV HeN-3)毒株的血清学中和试验,并通过实时定量PCR方法检测各组中PRRSV mRNA的绝对拷贝数,以抗血清的病毒阻断率≥70%的最大血清稀释度作为该血清的中和效价。结果显示:1)三种重组蛋白的抗血清对两种PRRSV毒株的中和效价均1∶2,不具有中和活性,部分稀释滴度的血清还增强了病毒的感染;2)抗PRRSV全病毒对照阳性血清对同源毒株的中和效价为1∶8,具有中和活性;对异源毒株的中和效价1∶2,不具有中和活性,同时还产生了ADE增强作用。上述研究结果提示,GP5的主要中和表位可能更多是构象表位,PRRSV全病毒中主要诱导中和抗体产生的蛋白可能并不完全在GP5蛋白上;PRRSV全病毒阳性抗血清虽然能够提供一定的免疫保护,但这种免疫保护只发生在同源毒株之间,对异源毒株并没有效果,反而会介导ADE效应发生。     

当H5N1 AIV混杂其他病毒时,抗血清的HI效价下降

<正>在对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)或其他有血凝素的病毒做血凝抑制试验时,有时会出现抗血清不能抑制病毒的异常情况,但当被检病毒纯化之后,抗血清对病毒的HI效价又正常了。     

鸡传染性贫血病毒VP3基因的原核表达及抗血清制备

为了研究鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CIAV)VP3蛋白与病毒自身蛋白之间的相互作用,需对该蛋白进行原核表达制备相应兔源抗血清,试验通过提取CIAV M9905株基因组DNA,PCR扩增出VP3基因,构建重组质粒pET30a(+)-VP3,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,进一步通过IPTG诱导表达后用Ni-NTA亲和柱纯化获得融合蛋白,经SDS-PAGE分析后对融合蛋白进行乳化,免疫新西兰兔制备抗血清,并对其进行ELISA效价测定、Western-blot及IFA检测。结果表明:SDS-PAGE分析证实获得高纯度的重组蛋白VP3,大小约为22 ku,且其在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在;ELISA法检测制备的兔源抗VP3血清效价在1∶6 400以上;经Western-blot及IFA检测证实,VP3兔源血清可特异性结合Vero细胞表达的VP3蛋白。说明试验成功表达出CIAV VP3蛋白,制备的兔抗血清具有较好的特异性。     

抗鸡传染性支气管炎病毒多克隆抗体的制备及其生物活性的鉴定

本试验将商品化疫苗株H120鸡传染性支气管炎病毒(IBV)直接免疫大白兔进行抗IBV全病毒粒子多克隆抗体的制备,通过琼扩试验及酶联免疫吸附试验检测其抗体效价,同时利用免疫组织化学、免疫荧光及Western blotting技术检测了所制备多抗血清的生物活性。试验结果表明,制备得到的多抗血清具有很高的抗体效价,同时能够与不同形式的IBV相关抗原发生特异性结合。     

免疫外科法分离山羊囊胚内细胞团的研究

分别用关中奶山羊脾脏细胞和胎儿成纤维细胞,免疫新西兰白兔各2只,共4只。通过3次静脉注射,每次注射4×108个细胞,间隔10 d,最后一次注射10 d后心脏采血制备抗血清,结果获得的4份抗血清均具有细胞毒性,由脾脏细胞免疫获得的抗血清溶解细胞的效价稍高。超排关中奶山羊24只和波尔山羊3只,6~9 d采胚共获得胚胎240枚,其中囊胚106枚,结果显示配种后7~9 d胚胎的发育阶段适宜于分离内细胞团(ICM)。细胞毒性试验表明,抗血清对关中奶山羊红细胞、囊胚和波尔山羊囊胚均具有细胞毒性作用。通过比较抗血清50%溶解山羊红细胞效价与溶解囊胚滋养层细胞效价的差异,发现后者的适宜效价是抗血清50%溶解山羊红细胞效价的22~23倍,表明采用易于获得的山羊红细胞作预试验可以为免疫外科分离山羊ICM提供抗血清稀释比例参考。免疫外科法分离ICM采用两步法进行,获得最佳参数如下:抗血清稀释比例为1∶4~1∶15,补体稀释比例为1∶20,先在抗血清中作用30 min,再在补体中作用20~30 min,吹打除去溶解的滋养层细胞后即可获得ICM。分离得到的ICM形态特征与胚胎质量密切相关。山羊ICM接种于丝裂霉素处理过的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层后,2 d内贴壁。4~7 d后,ICM增殖为胚胎干细胞样集落,其周围出现大量空泡样细胞。     

泰氏锥虫抗原制备及实验室诊断研究

应用体外培养的泰氏锥虫制备可溶性抗原Ⅰ、抗原Ⅱ和代谢抗原.经测定,其蛋白含量每毫升分别为6.5mg、7.4mg和7.1mg.薄层等电聚焦电泳测定结果表明,抗原Ⅰ出现22条区带,抗原Ⅱ21条区带,代谢抗原28条区带,对照的伊氏锥虫琼脂免疫扩散抗原14条区带.经分析,泰氏锥虫抗原和伊氏锥虫抗原有4条区带在同一迁移率上.琼脂免疫扩散反应中,3种泰氏锥虫抗原均与相应免疫兔血清发生沉淀反应,抗原Ⅰ出现1条致密沉淀线,抗原Ⅱ和代谢抗原出现2～3条沉淀线,抗原效价为1:4～16.免疫电泳显示了类似的结果,抗原Ⅰ与免疫兔血清出现1条弧形沉淀线,抗原Ⅱ和代谢抗原与免疫兔血清出现了3条弧形沉淀线.间接血凝试验结果表明,泰氏锥虫自然感染牛血清效价为1:20～40,免疫兔血清为1:1280～5120.所制泰氏锥虫抗原对伊氏锥虫和媾疫锥虫血清也能很好地发生交叉反应,3份伊氏锥虫病马血清和3份伊氏锥虫人工感染兔血清血凝效价分别为1:10～40和1:8～1024;5份媾疫马血清有4份血凝效价为1:20～320.4份环形泰勒虫病牛血清均为阴性.