一份安康野桑蚕线粒体COI序列的克隆和分析

对1份安康野桑蚕线粒体进行了克隆分析,获得了一段长度为1 873 bp的线粒体序列,包含COI基因及其侧翼序列。序列比对表明其与石泉的2份野桑蚕存在48处碱基差异,聚类分析表明其与岚皋县、山东青州共同聚类,与家蚕亲缘关系较近。对6份安康野桑蚕在内的19份不同地域来源的野桑蚕及31份家蚕线粒体COI序列进行了单位点多态性和聚类分析。结果表明:17份中国野桑蚕在67个位点上存在多样性,平均核苷酸差异为25.596,2份日本野桑蚕之间的多态性位点为10个,平均核苷酸差异为10.000;6份安康野桑蚕可分为两大类,其一是石泉县2份野桑蚕与湖南、四川、江苏、湖北等地野桑蚕聚为一大类群,与家蚕亲缘关系较远,其二是包括本次研究在内的4份安康野桑蚕及山东青州野桑蚕与家蚕聚为一大类群,与家蚕亲缘关系较近,显示出安康野桑蚕复杂多样的遗传特性。研究为深入分析安康野桑蚕的遗传多样性,发掘安康野桑蚕种质资源提供理论依据。     

水稻线粒体基因atp6启动子突变导致的一种细胞质雄性不育型

内江杂交水稻科技开发中心从恢复系 "万恢88/内恢92-4" 杂交组合F2代不育株选育的细胞质不育系,被暂时定名为"万恢88型水稻细胞质雄性不育系".利用PAGE电泳、琼脂糖凝胶电泳和克隆测序等技术对其不育系和保持系线粒体基因组进行研究,分析其雄性不育的分子基础和分子机理.通过PAGE电泳发现,其不育系线粒体基因组PCR带型与野败型(WA)、印水型(ⅡA)、D型(Di)、冈型(GA)存在差异.对其不育系内香2A和保持系内香2B的差异片段回收测序,获得两条667 bp长度的mtDNA片段2A和2B,通过序列比对和电子杂交分析,获得片段为atp6基因的部分序列及其上游序列.2A和2B相比有3个碱基不同,分别是第57位G→T,第100位T→C,第161位C→T.功能分析第100 位T-C点突变使atp6基因启动子核心序列遭到破坏.通过对atp6基因上游序列的RT-PCR分析,发现不育系内香2A的atp6基因不能正常表达.故而推测万恢88型水稻细胞质雄性不育是由于不育系线粒体atp6基因核心启动子区域发生点突变,导致atp6基因不能正常转录,致使线粒体供能不足,最后导致花粉败育.     

陕西秦巴山区野桑蚕线粒体COⅠ序列的遗传多样性与系统进化分析

【目的】分析野桑蚕(Bombyx mandarina)的遗传多样性,为发掘和利用其基因资源提供参考。【方法】克隆8份秦巴野桑蚕线粒体COⅠ序列,联合GenBank中39份家蚕、17份野桑蚕COⅠ序列,用DnaSP 5.0软件统计核苷酸多样性和单倍型多样性,采用MEGA X软件构建系统发育树,Network 5.0软件构建单倍型中介网络。基于64份COⅠ序列进行聚类分析,分析遗传多样性和单倍型中介网络,探讨家蚕起源。【结果】克隆了8份秦巴野桑蚕线粒体COⅠ及其侧翼序列,序列长1 531 bp,序列间存在18处核苷酸变异,定义了4个单倍型,8份秦巴野桑蚕与沈阳、青州等北方野桑蚕亲缘关系最近。系统发育树将64份线粒体COⅠ序列聚为4个类群,其中中国野桑蚕聚为2个类群,一是来自陕西、辽宁、山东等的北方野桑蚕,与家蚕遗传距离为0.007 21;二是来自江苏、湖北、重庆等的南方野桑蚕,与家蚕遗传距离为0.019 59;日本野桑蚕群体与家蚕遗传距离为0.031 96。64份COⅠ序列共存在84处单碱基变异位点,定义了31种单倍型。单倍型中介网络图显示,31种家蚕、野桑蚕单倍型总体上可分为3个支系,其中单倍型H_22可能为家蚕祖先单倍型。【结论】秦巴山区野桑蚕与北方省份的野桑蚕亲缘关系最近,秦巴山区可能是家蚕驯化的起源地之一。     

野桑蚕br-c基因的克隆与序列分析

昆虫BR-C(Broad complax)蛋白是一个含BTB结构域和锌指结构域的转录因子,介导蜕皮激素20E和保幼激素JH的信号转导,是昆虫变态发育调控的关键基因之一。研究克隆了野桑蚕br-c基因开放阅读框及其上下游的部分非翻译区序列,并对该基因编码序列进行了特征分析。结果表明:野桑蚕BR-C蛋白具有保守的BTB和ZnF-C2H2结构域,N端含有胞外区、跨膜区和胞内区等结构。聚类分析表明:家蚕与野桑蚕在亲缘关系上最为接近,其BR-C蛋白序列基本一致。     

洋葱atp6基因的克隆与系统进化分析

细胞质雄性不育(CMS)在作物遗传育种研究中占有重要地位,多种植物的细胞质雄性不育均与线粒体基因结构变异及新嵌合基因的产生有关。为探索线粒体atp6基因与洋葱CMS的关系,以13份不育系和11份保持系为材料克隆洋葱atp6基因编码序列,测序结果表明不同材料atp6基因间存在一个C/A多态性位点,该多态性位点在不育系和保持系间随机出现,而不是不育系与保持系的特征差异。蛋白质分析表明这一多态性位点的变异并未改变atp6蛋白跨膜结构。进一步的蛋白比对分析揭示了atp6蛋白在物种间有一定的保守性,特别是第IV跨膜结构域的Arg在所有物种中是高度保守的,也是H+转运所必需的。基于atp6蛋白序列的系统进化树显示细菌和病毒位于树的基部,其次是真菌、低等藻类以及原生生物,然后高等藻类、苔藓和蕨类,高等绿色开花植物处于树的顶端,单子叶植物处于树的最顶端。     

红麻线粒体基因atp6过表达载体的构建与转化

【目的】构建红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系,为红麻线粒体基因的遗传转化及功能研究打下基础。【方法】以红麻UG93A花药cDNA为模板,通过同源克隆技术克隆atp6基因编码区(CDS)的全长序列;利用In-Fusion基因融合技术构建植物过表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型烟草,并对转基因阳性烟草植株进行抗性筛选和PCR验证。【结果】红麻UG93A的atp6基因CDS全长为1182 bp,成功构建红麻atp6基因全长过表达载体pBI121-atp6-EGFP,并获得4株转基因烟草植株(B1、B2、B3和B4),使用过表达载体上3对不同位点的引物组合对转基因植株进行PCR验证,发现有2株转基因烟草植株在3对不同引物中稳定表达,即获得2株含pBI121-atp6-EGFP的T_0代转基因阳性植株(B1和B2)。【结论】构建的红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系,可用于指导后续atp6基因调控红麻细胞质雄性不育(CMS)分子机理研究。     

陆地棉胞质雄性不育系与保持系线粒体基因组RFLP分析

【目的】研究棉花细胞质雄性不育（CMS）系与保持系线粒体基因组的差异,为克隆棉花CMS基因奠定基础。【方法】以atpA, atp6, atp9, ccmB, ccmC, ccmFN1, cob, coxI, coxII, coxIII, matR, nad1bc, nad2, nad4, nad5, nad6, nad7c, nad9, rpl5, rrn18等20个线粒体基因保守序列为探针,利用Southern blot方法对棉花细胞质雄性不育系、保持系线粒体基因组进行RFLP分析。【结果】发现atpA、atp9、ccmB、nad1bc、nad6、nad7c、rrn18等基因在棉花不育系和保持系间存在明显RFLP多态性,其中atpA的差异最明显。【结论】atpA是棉花CMS系和保持系线粒体基因组间的一个明显差异位点。CMS系比保持系缺失一个rrn18拷贝。     

野桑蚕foxo同源基因的克隆和序列分析

FOX蛋白家族(Forkhead box family,FOX)在昆虫眠性、生长及变态发育等过程中起到重要作用。研究克隆了野桑蚕FOX蛋白家族中的foxo同源基因ORF框及其上下游部分UTR序列,比较了与家蚕同源序列的异同。结果表明野桑蚕foxo基因ORF框长度为1 539 bp,编码512个氨基酸残基。野桑蚕与家蚕foxo基因在核酸序列上存在13处单碱基差异,但两者蛋白序列完全一致。序列分析表明,野桑蚕foxo编码蛋白含有保守的fork-head结构域和FOXO蛋白特有的TAD结构域。进化分析表明,野桑蚕foxo与家蚕亲缘关系最为接近,脊椎动物和昆虫各亚目可按照foxo序列聚为亚群,表明foxo保守性的同时也具有各物种独特的特征。研究在深入开展野桑蚕foxo基因功能分析及其在变态发育过程中的功能研究方面具有一定理论指导意义。     

野桑蚕核糖体蛋白L21基因的克隆及序列分析

[目的]克隆野桑蚕(Bombyx mandaina)核糖体蛋白L21(RPL21)基因并进行半定量分析,为研究RPL21基因在昆虫体内的生物学功能提供参考.[方法]采用RT-PCR克隆野桑蚕RPL21基因序列,并采用半定量PCR分析该基因在野桑蚕4龄幼虫不同组织中的表达情况.[结果]扩增获得的野桑蚕RPL21基因序列全长为586 bp,其包含一个完整的开放阅读框(ORF),长度为480 bp,编码159个氨基酸;预测蛋白的分子量和等电点分别为18 kDa和11.01.序列比对结果表明,野桑蚕与其他12个物种的RPL21基因的相似性介于55.5%~91.6%,其中与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)RPL21的相似性最低,与家蚕(Bombyx mori)的相似性最高.半定量分析结果表明,野桑蚕RPL21基因在野桑蚕幼虫的中肠、丝腺、脂肪体、血液、睾丸、表皮、卵巢和脑组织中均有表达,且转录水平无明显差异.[结论]野桑蚕RPL21基因进化较保守,在各组织中分布广泛且表达水平稳定.     

ORFV-Yulin株的分离鉴定及其B2L基因在昆虫杆状病毒系统中的表达

【目的】从榆林市具有典型羊口疮症状的陕北白绒山羊唇结痂病料中分离羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),克隆分析其B2L基因序列,并通过昆虫杆状病毒表达B2L基因。【方法】利用牛肾传代细胞进行ORFV的分离培养,通过PCR的方法从分离到的病毒中扩增出B2L全长基因,测序后进行序列及遗传进化分析。利用扩增所得的B2L基因构建昆虫杆状病毒表达载体,包装出杆状病毒后侵染sf9细胞,并通过SDS-PAGE、Western-blot以及质谱鉴定等方法验证目的基因的表达情况。【结果】成功分离出1株羊口疮病毒,命名为ORFV-Yulin株;扩增的B2L全长基因长度为1 137bp,与Hub13和GY-AHF10株亲缘关系最近,核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为99%和99.2%。通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了B2L基因,获得了47ku的重组蛋白。【结论】从榆林市陕北白绒山羊中获得了羊口疮病毒分离株(ORFV-Yulin);通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了ORFV-Yulin株的B2L基因。     

野桑蚕核糖体蛋白L21基因的克隆及序列分析（英文）

【目的】克隆野桑蚕(Bombyx mandaina)核糖体蛋白L21(RPL21)基因并进行半定量分析,为研究RPL21基因在昆虫体内的生物学功能提供参考。【方法】采用RT-PCR克隆野桑蚕RPL21基因序列,并采用半定量PCR分析该基因在野桑蚕4龄幼虫不同组织中的表达情况。【结果】扩增获得的野桑蚕RPL21基因序列全长为586 bp,其包含一个完整的开放阅读框(ORF),长度为480 bp,编码159个氨基酸;预测蛋白的分子量和等电点分别为18 k Da和11.01。序列比对结果表明,野桑蚕与其他12个物种的RPL21基因的相似性介于55.5%~91.6%,其中与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)RPL21的相似性最低,与家蚕(Bombyx mori)的相似性最高。半定量分析结果表明,野桑蚕RPL21基因在野桑蚕幼虫的中肠、丝腺、脂肪体、血液、睾丸、表皮、卵巢和脑组织中均有表达,且转录水平无明显差异。【结论】野桑蚕RPL21基因进化较保守,在各组织中分布广泛且表达水平稳定。     

羊口疮病毒榆林株B2L和F1L串联基因在昆虫杆状病毒系统的表达

【目的】克隆分析羊口疮病毒(ORFV)榆林株(ORFV-Yulin)的F1L基因序列,通过昆虫杆状病毒表达B2L和F1L串联基因。【方法】采用PCR方法扩增ORFV-Yulin株F1L全长基因,测序后对其进行序列分析和遗传进化分析。扩增ORFV-Yulin株B2L融合基因(r B2L)和F1L融合基因(c F1L),利用碱基linker连接,通过重叠PCR方法扩增获得ORFV r B2L-linker-c F1L重组基因(r B2Lc F1L),将其与昆虫杆状病毒表达载体pBac5连接构建表达载体pBac-rB2LcF1L。将pBac-rB2LcF1L包装出杆状病毒,侵染sf9细胞,通过SDS-PAGE、Western-blotting以及质谱鉴定等方法验证目的基因r B2Lc F1L的表达。【结果】克隆获得了1 029bp的F1L全长基因,该基因高度保守,与FJ-MH2015株的序列相似性最高,核苷酸和氨基酸的相似性分别为99.0%和99.4%。系统进化分析表明,ORFV-Yulin株与XP(KU199840.1)、FJ-MH2015(KM675409.1)以及Shanxi(HQ221964.1)株同处于一个分支。PCR扩增获得了855bp的c F1L基因、1 180bp的r B2L基因及1 983bp的r B2Lc F1L基因,成功构建了pBacrB2LcF1L载体,并包装出相应的杆状病毒。B2L和F1L串联基因通过昆虫杆状病毒表达系统获得成功表达,表达产物的分子质量为80ku,且有部分重组蛋白能分泌到细胞培养基中。【结论】ORFV-Yulin株的B2L和F1L串联基因在昆虫杆状病毒系统表达成功。     

桑蟥DNA条形码与系统进化分析

动物的线粒体细胞色素酶C亚基Ⅰ基因(COI)是进行种质资源鉴定的DNA条形码序列。本文利用PCR扩增和DNA测序技术获得桑蟥(Rondotia menciana Moore) COI 5′端618 bp的基因片段(GenBank登录号:JX195182),与家蚕和野桑蚕该段线粒体基因序列的一致性达99%,但更偏好于使用碱基T。在所分析的蚕类昆虫中,桑蟥与野桑蚕、家蚕的遗传距离最小,与栗蚕的遗传距离最大。构建的NJ和UPGMA分子树中,与蚕蛾科昆虫野桑蚕、家蚕聚合在同一分支。     

家养双峰驼SRY基因的序列分析与拷贝数研究

为探究中国家养双峰驼SRY基因的序列以及群体间拷贝数变异,对7个中国家养双峰驼群体共94个个体的SRY基因部分序列进行测序,分析SRY基因序列与其他物种的相似性;并且以CYP2A基因为内参基因,运用实时荧光定量PCR技术检测SRY基因的拷贝数。结果表明,中国家养双峰驼与人、马、猪、羊及普通牛的SRY基因相似度分别为67.7%~68.1%、68.5%~69.4%、73.8%~74.4%、73.8%~74.8%、74.1%~74.8%。在家养双峰驼SRY基因的多个拷贝中,除1个拷贝外,其余拷贝的HMG序列与羊驼、人、马、猪、绵羊及普通牛的HMG序列相比,相似度分别为97.3%、84.2%、85.6%、86.3%、87.0%、85.6%。SRY基因在中国家养双峰驼Y染色体上以多拷贝形式存在,变幅为1~9个拷贝。表明中国家养双峰驼SRY基因的HMG序列是高度保守的,而且该基因属于多拷贝基因。     

orf160在不同棉花CMS胞质中的表达分析

[目的]研究不同来源的不育系是否具有相似的遗传背景和相同的不育候选基因.[方法]利用PCR,RT-PCR技术,以及Northern blot技术分析orf160及其周边序列在104-7A,湘远A,晋A,HAMS277等棉花不育衍生系线粒体中存在状况及表达.[结果]发现orf160在被调查的CMS系中均存在,且均有转录,而且在P30A(104-7A的衍生系)中与其上游atp4基因间均为单独转录;同时发现orf160在被调查的CMS系中具有相似的旁侧序列.[结论]被调查的CMS系线粒体均含有orf160基因及基本一致的旁侧序列;作为不育候选基因的orf160,与其上游的atp4基因不存在共转录现象.     

陕西关中某羊场羊口疮病毒的分离鉴定与基因序列分析

羊口疮疫病的暴发可严重影响畜牧的经济效益,为探明陕西地区该病的发病原因。本研究从陕西关中地区某羊场出现特征症状病羊嘴部痂皮中分离病原,经过感染MDBK细胞系,获得1株病毒,经形态学、理化学、PCR检测及病理组织学等方法鉴定,该病毒分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV),命名为ORFV-SXGZ。依据GenBank中发表的ORFV特异性B2L、F1L及VIR基因的核酸序列,设计并合成3对引物,应用PCR方法成功对ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L及VIR基因进行克隆,并将其基因序列及推导的氨基酸序列与其他不同来源ORFV分离株进行比较分析。序列分析结果表明,ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L和VIR基因与其他已发表ORFV毒株之间的核苷酸同源性分别为96.7%~99.6%、95.8%~97.9%和95.0%~99.3%,氨基酸同源性分别为95.3%~99.7%、95.8%~98.2%和95.5%~98.4%。系统进化树分析结果显示,ORFV-SXGZ毒株与国内新疆和甘肃等西北部地区分离株的亲缘关系更近,证实陕西关中地区养殖场中存在羊口疮病毒感染。     

野桑蚕scalloped同源基因的克隆和序列分析

Hippo通路与昆虫的生长、发育和变态等过程密切相关,在动物不同物种之间高度保守。scalloped基因是Hippo通路元件Yki的偶联因子之一,参与调控基因的表达。克隆了野桑蚕(Bombyx mandarina)scalloped基因的完整开放阅读框(ORF)及其上下游的部分非编码序列。序列联配分析表明,与家蚕相比,野桑蚕scalloped基因序列存在多处的核酸片段缺失、插入及位点差异。结构域分析表明,野桑蚕Scalloped蛋白与家蚕、黑腹果蝇、小鼠和人的蛋白结构类似,均含有完整的TEAD蛋白家族典型TEA结构域和PDB结构域,但野桑蚕编码蛋白缺失蛋白C末端序列。系统发生树分析表明,昆虫Scalloped蛋白与脊椎动物TEF3可能存在共同的起源;家蚕Scalloped在进化中出现晚于野桑蚕且经历较多遗传选择过程。     

石河子垦区犬瘟热病毒流行株H基因遗传变异分析

为了解石河子垦区的CDV流行株H基因遗传变异特点,设计2对特异性引物,通过RT-PCR方法对29份临床疑似犬瘟热的病料进行检测,对于检测CDV阳性的病料进行流行株H基因克隆、测序和序列分析,结果检测出7份阳性病料。序列分析发现,7个流行株H基因之间的同源率在91.0%～98.9%,与疫苗株(FJ461699.1)的同源率为86.9%～91.7%,存在一定的变异。糖基化位点及抗原表位预测分析发现,与参考株Onderstepoort相比,7个流行株推导的H蛋白糖基化位点、抗原表位均有不同程度的改变。遗传进化分析显示,CDV shz1~CDVshz6亲缘关系较近,它们与CDVshz7相距较远。研究结果提示,石河子垦区发病犬中存在CDV变异株。     

水稻线粒体基因atp6超表达载体的构建及遗传转化(英文)

[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5′∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5′)的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5′∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。     

K型小麦雄性不育系及其保持系花药小孢子不同发育期ATP酶活性变化

近年来,越来越多的研究表明,线粒体DNA与雄性不育密切相关。线粒体基因atpA,atp6,atp9在小麦雄性不育系与保持系之间存在不同程度的组织结构差异,且它们的RNA编码异常〔1,4〕。atpA、atp6和atp9是线粒体基因参与ATP酶合成的3个功能性基因,ATP酶是生物能量代谢过程中具重要生理功能的一种酶。但迄今为止还未见到有关该酶在不育花药中超微细胞化学定位的报道。本研究选用了K型雄性不育系和其保持系为材料,利用电镜细胞化学标记技术,对其小孢子发育的各个时期,花药组织中的ATP酶活性变化进行定位分析,从翻译产物水平上探讨线粒体3种基…