乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39特异性单克隆抗体的制备

为了制备乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位特异性单克隆抗体,将编码乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39的DNA序列进行人工合成,随后插入表达载体pGEX-6p-1的限制性酶切位点BamHⅠ与XhoⅠ之间,构建了表位肽与GST的融合表达质粒。该表住融合蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB／c小鼠,按常规方法进行细胞融合。以化学合成的E39表位多肽为抗原,对融合细胞上清进行间接ELISA筛选。结果,筛选出1株分泌E39表位特异性抗体的杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞分泌抗体能力稳定。经鉴定,该单克隆抗体亚型为IgG2b,轻链类型为κ链。结果表明,用表位融合蛋白为抗原可以制备表位特异性单克隆抗体。     

乙型脑炎病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ结构域抗原表位鉴定

为鉴定乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白I,II结构域抗原表位,本研究设计了一系列针对E蛋白的I、II结构域(1aa～296aa)部分重叠短肽,分别进行GST融合表达,用JEV阳性血清进行western blot和ELISA反应性筛选,获得了5个线性抗原表位分别为:E1(1FNCLGMGNRDFIEGAS16)、E10-4(77TGEAHNEK84)、E11-2(83EKRADSS YVCKQ94)、E19(145GTTTSENHGNYSAQVG160)和E33(257SQEGGLHHALAGAIVV272)。除E10和E19外,其它表位均为第一次通过实验方法确定的。将这5个融合蛋白对小鼠进行免疫,获得了高滴度的针对5个融合短肽的抗血清,研究证明了这些表位具有良好的免疫原性。本研究为乙型脑炎特异性诊断试剂及表位疫苗的开发奠定了基础。     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选

为筛选日本乙型脑炎病毒(JEV)的E抗原表位,本实验以抗JEV E蛋白的单克隆抗体(MAb)作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体七肽库,挑取噬菌体单克隆培养并采用MAb包被的ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEV E抗原模拟表位的氨基酸序列.设计合成包含该表位的E抗原15肽(E-365GGADSMSMAGMAVSYE-379)cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达质粒,诱导表达重组多肽并进行western blot验证.经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆采用MAb包被进行ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性.对重组多肽进行western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多克隆抗体.本实验成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为开展用JEV抗原表位探索JEV的防制研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要依据.     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原优势区域的鉴定

流行性乙型脑炎（Japanese Encephalitis,JE）是一种人与动物共患的虫媒病毒性疾病,严重危害着人畜的健康。E蛋白是乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。为了确定该蛋白的抗原优势区域,本研究设计了3对引物,将E蛋白分成3个大段,分别是EF1（1～291aa）、EF2（292～402aa）和EF3（403-500aa）,又将EF1分成4个相互重叠的小片段,分别是EF1-1（1～88aa）、EF1—2（68～155aa）、EF1—3（129～222aa）和EF1—4（202～291aa）,将以上基因片段分别克隆到原核表达载体进行GST融合表达。SDS-PAGE电泳鉴定各融合蛋白均获得表达,各表达产物以包涵体的形式存在。通过Western blot分析表明融合蛋白GST-EF1、GST—EF2、GST—EF1—1、GST-EF1-2、GST—EF1—3和GST—EF1～4均能被阳性血清识别。通过ELISA鉴定,GST-EF2反应性最强,GST-EF1反应性比GST-EF2稍弱,而GST-EF3反应性最弱,GST-EF1-1、GST-EF1—2、GST-EF1—3和GST—EF1—4片段融合蛋白反应性与GST—EF1相似。由此本研究鉴定出1-402aa是E蛋白的抗原优势区域,在此区域内包括了12个Cys的保守区及域Ⅰ、域Ⅱ和域Ⅲ3个主要抗原域。E蛋白抗原优势区域的鉴定,为E蛋白抗原表位的鉴定以及针对于E蛋白诊断试剂的开发奠定了基础。     

猪瘟病毒E2蛋白抗原表位的研究

蛋白质抗原表位 (抗原决定簇 )是蛋白质抗原性的物质基础 ,一个蛋白质分子可带有多个不同的抗原决定簇 ,即抗原表位 (epitopes)。通常 ,抗原表位是指氨基酸序列已经清楚的抗原决定簇。蛋白质抗原表位的研究 ,对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义。B细胞蛋白抗原表位的预测自从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的方法以来 ,已有许多参数、算法发表 [1～10],对B细胞蛋白抗原表位研究起到了巨大的推动作用。本文就猪瘟病毒(SFV)E2蛋白抗原表位的研究概况作一介绍。1猪瘟病毒E2抗…     

利用随机肽库鉴定猪瘟病毒E2蛋白抗原表位

利用噬菌体随机12肽库对抗猪瘟病毒（classical swine fever virus CSFV）糖蛋白E2特异的单抗A11进行表位鉴定，经过4轮筛选后，随机挑取10个噬菌体克隆作竞争ELISA检测。结果表明，10个克隆中除4号克隆外，其余9个均能抑制原核表达的E2蛋白和A1l单抗之间的抗原抗体反应，抑制率在35％～64％；DNA测序表明，所有产生竞争抑制作用的8个噬菌体克隆的12肽序列均舍有XXWRXXXL核心序列，而没有抑制作用的克隆则不含该核心序列；Western-blot试验证明，所挑阳性克隆均能被单抗A11识别。多序列比较发现，该核心序列与猪瘟病毒E蛋白的28～35位氨基酸TTWKEYSH有一定的同源性，人工合成的含有部分核心序列氨基酸的多肽可以与单抗A11反应，表明单抗A11所针对的抗原表位位于CSFVE2蛋白的28～35位氨基酸。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒。表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白。本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,经有限稀释法获得1株特异性针对JEV E蛋白的杂交瘤细胞,命名为5D4,经测定5D4单抗亚类属于IgG2a,轻链为κ链。经Western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体可特异地与JEV E蛋白结合。结果表明,所制备的抗JEV E蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为JEV准确快速的病原诊断和JEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选与鉴定

筛选日本乙型脑炎病毒（JEV）的E抗原表位,为开展用JEV模拟表位探索JEV的防治研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要的线索和依据。以抗JEvE蛋白的单克隆抗体作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体7肽库,挑取噬菌体单克隆培养并ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEVE抗原模拟表位的氨基酸序列。设计合成包含该表位的E抗原15肽（GGADSMSMAGMAVSY）cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达载体,诱导表达重组多肽并west-ernblot验证。经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性。对重组多肽进行Western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多抗。应用上述方法成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为下一步研究奠定了基础。     

抗东方马脑炎病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合.以原核表达载体pET-30a表达并纯化的EEEV E2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,获得4株稳定分泌抗EEEV E2蛋白MAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为6F3、6F11、7C11、8B11.Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的4株MAbs均与EEEV呈阳性反应,而与西方马脑炎病毒、乙型脑炎病毒以及登革热病毒1型～4型呈阴性反应.利用部分重叠的原核表达的短肽对E2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 6F11、7C11和8B11识别的抗原表位均为E-33 (321EGLEYTWGNHPPKRVW336),而MAb 6F3无短肽与其反应,推测可能为构象表位.本研究结果为建立EEEV型特异性检测方法、研究E2蛋白结构功能及该病的进一步防制奠定了基础.     

猪乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ原核表达和抗原性分析

为分析猪乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白Ⅲ结构域的抗原性,本研究克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的E蛋白结构域Ⅲ,并通过pET-28a载体进行融合表达和纯化。用纯化后蛋白作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,通过SDS-PAGE、Western blotting、间接ELISA及间接免疫荧光方法(IFA)检测小鼠及猪抗体滴度,验证E蛋白结构域Ⅲ的抗原性。SDS-PAGE结果表明融合蛋白以包涵体形式表达;Western blotting、间接ELISA检测结果表明表达产物具有良好的抗原性;纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠ELISA方法检测特异性抗体滴度可达1×10⁵;猪JEV阳性血清ELISA抗体滴度可达5.1×10⁴;IFA结果表明JEV E Ⅲ蛋白产生的抗血清能很好的识别乙型脑炎病毒抗原。以上结果表明,表达、纯化的重组JEV E Ⅲ蛋白具有良好的抗原性。本试验结果为建立以E蛋白结构域为抗原的诊断方法提供了重要依据。     

乙型脑炎病毒NS1蛋白的可溶性表达与抗原性分析

为获得可溶性表达的乙型脑炎病毒(JEV)NS1蛋白,将编码JEV SA14-14-2株NS1蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-c5X中,构建重组融合表达质粒pc5X-NS1;用重组质粒转化宿主菌ER2523后,经IPTG诱导得到可溶性的融合蛋白MBP-NS1;优化诱导表达条件,于28℃、0.3 mmol/L IPTG诱导4 h;最后融合蛋白经直链淀粉树脂柱纯化。结果表明:重组融合蛋白MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性。     

日本乙型脑炎病毒的分离与鉴定

收集一例疑为乙型脑炎病毒感染的种公猪肿大的睾丸病料,并将其处理制成匀浆过滤后,用乳鼠脑内接毒和细胞接毒相结合的方法盲传并分离病毒,然后设计一对PrM/E基因的特异性引物,采用RT-PCR方法对所分离的病毒进行鉴定,并将其PrM/E基因扩增产物测序,测序结果与乙型脑炎GenBank登陆的SA14-14-2株(AF315119)和SA14株(U14163)进行比较。结果表明,所分离病毒的PrM/E基因序列与JEV强毒株SA14和弱毒株SA14-14-2相应序列同源性分别为98.1%和97.1%,证实分离毒株为乙型脑炎病毒。     

狂犬病病毒糖蛋白基因中和抗原表位在大肠杆菌中的串联表达

采用RT-PCR方法从狂犬病病毒HEP株中克隆狂犬病糖蛋白膜外区全长基因。利用突变PCR方法,将糖蛋白基因中三段中和抗原位点串联,克隆至pET-28a表达载体。阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导表达并确定最佳诱导条件。SDS-PAGE电泳结果显示所表达的蛋白大小与预期相符。经Western-blotting检测,串联表达的狂犬病糖蛋白基因中和抗原位点可与狂犬病标准阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的反应原性。     

JEV分子生物学与新型疫苗研究进展

流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV)是一种严惩危害人畜健康的虫媒病毒。本文对JEV的基因组结构、结构蛋白、非结构蛋白及其功能、重组活疫苗和核酸疫苗的研究现状以及与常规疫苗相比所具有的优缺点等方面进行了较为详尽的综述，并且提出JEV复制的确切机制及其蛋白尤其是非结构蛋白的结构与功能尚需深入研究，以期为坦步改良JE新型疫苗打下基础。     

稳定表达乙型脑炎病毒NS1蛋白细胞系的建立

为建立稳定表达乙型脑炎病毒(JEV) NS1蛋白的真核细胞系,本研究将编码JEV NS1蛋白的人工合成基因克隆到真核表达载体pCAGG-TK-neo中,构建了重组质粒pCAGG-opti-NS1.重组质粒经脂质体转染RK-13细胞,以含G418的选择性培养基选择培养,经细胞克隆纯化,以间接免疫荧光试验(IEA)筛选表达目的基因的细胞.结果表明,转染的RK-13细胞经G418加压及IFA筛选后,获得表达JEV NS1蛋白的阳性RK-13细胞系.经RT-PCR、western blot和IFA鉴定,该细胞系在传代至第15代后仍然可以稳定表达NS1蛋白.本实验获得了能够稳定表达JEV NS1蛋白的细胞系,为进一步开展JEV相关的研究奠定了基础.