兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析

自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒，提取病毒总RNA，以RT－PCR方法扩增得到RHDV VP60基因全长片段，克隆到T载体中，经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行3次测序，测序结果已输送到GeenBank中（注册号为AF453761）。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明：各毒株间核苷酸的同源性为91％－98％，氨基酸同源性为94％－99％，氨基酸变异多发生在高变区，进一步证明了毒株的高度保守性，为明确我国RHDV地方株VP60蛋白的分子特征、分子诊断试剂及新型疫苗的研制奠定了基础。     

与兔出血症病毒VP60蛋白相互作用蛋白的初步鉴定

为获得与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)相互作用的细胞蛋白,本研究以pMD-VP60重组质粒为模板扩增RHDV的VP60基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-VP60,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达GST重组蛋白(rVP60),western blot分析表明该蛋白具有与VP60单克隆抗体(MAb)良好的反应原性。以亲和层析纯化的rVP60进行pull-down实验,从兔的肝脏细胞膜蛋白中获得与VP60相互作用的蛋白,多肽质量指纹图谱分析表明,其相互作用的蛋白为ATP合成酶β亚基,提示该蛋白可能与RHDV的感染相关。     

兔出血症病毒Yaan株衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序.结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸.将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90.5%～97.5%,氨基酸同源性为94.3%～99.5%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;同时对Yaan株与国外标准株AST/89的VP60蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行了比较分析.     

兔病毒性出血症病毒 VP60蛋白基因研究进展

兔病毒性出血症病毒（RHDV）是引起兔病毒性出血症（RHD）的病原,严重威胁着世界养兔业的健康发展。在RHDV的感染和免疫研究方面,RHDV 的衣壳蛋白VP60作为具有重要免疫原性的主要结构蛋白备受关注,论文对V P60蛋白基因的结构特征、核苷酸变异情况及在诊断方法建立和疫苗预防研究等方面进行了综述,为RHDV防控相关研究提供有用的参考资料。     

兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用

VP60是免出血症病毒（RHDV）的主要结构蛋白，也是免疫原性蛋白，与诱导抗病毒免疫反应直接相关，因而也是检测用首选抗原。本实验在原核系统pPRoEX^TMHTa中表达了VP60基因，经SDS—PAGE电泳中可见表达带。Western blot鉴定结果表明，重组蛋白可被RHD阳性血清特异性识别，具有相应的抗原性。将表达蛋白经SDS—PAGE电泳切胶纯化后免疫BALB／c小鼠，免疫血清经全病毒ELISA检测，效价可达1：3200-1：6400，经琼脂扩散试验检测效价为1：16。重组蛋白纯化、复性后，作为包被抗原初步建立了间接ELISA方法，并检测了48份免血清样品，与全病毒间接ELSIA试剂盒检测结果相同。实验结果表明．用原核系统表达的VP60蛋白．可以作为RHD新型诊断试剂的候选抗原。     

中国株兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性鉴定

应用RT—PCR技术扩增编码兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)WX84株衣壳蛋白VP60基因，将PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，在1．0mmol／L 1PTG和37C的条件下诱导，VP60—GST基因融合蛋白获了高效表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和western-blotting试验证实所表达的融合蛋白产物相对分子质量与预期的87000相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠，所得抗血清应用间接ELISA检测，与RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明，大肠杆菌中表达的RHDVVP60融合蛋白在抗原性上与天然衣壳蛋白具有一定的相似性。     

兔病毒性出血症病毒YL株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆和生物信息学分析

应用RT-PCR方法从兔出血症病毒（RHDV）西北分离株YL株中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,测序结果在GenBank中注册（登录号为DQ530363）。从GenBank下载全部已发表的40株RHDV序列,运用生物信息学软件分析,构建系统进化树和氨基酸序列同源性表,结果表明,世界不同地区RHDV分离株基因序列虽然非常保守,达到90%以上,但可以分为5个基因群,并且基因型和地域性没有必然联系,中国的分离株除了WX84株外,其它均处于第V基因群,该基因群内近年分离出的中国4个不同大地区（西北、华东、东北、西南）的RHDV毒株与NJ85株遗传距离很近,很可能都来自同一毒株NJ85。同时,对4个不同大地区的近年的4个代表性分离株的二级结构、抗原性进行了预测分析,结果显示二级结构有一定差异,但抗原性相同,这与RHDV只有一个血清型的看法相一致。     

兔出血症病毒VP60蛋白真核表达及其免疫原性研究

将兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建pcDNA-VP60,并将其转染Vero细胞.间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测pcDNA-VP60在细胞中的表达情况,同时将pcDNA-VP60免疫实验兔,观察血清中特异性抗体变化情况.试验结果表明,本文构建的pcDNA-VP60不仅能在Vero细胞中表达VP60蛋白,而且能够诱导机体产生免疫应答.     

兔出血症病毒RC株VP60基因扩增与序列分析

本实验应用RT—PCR方法从兔出血症病毒荣昌分离株（RHDV—RC）中扩增出衣壳蛋白VP60基因并测序,从GenBank下载已发表的16株RHDVVP60序列,运用生物信息学软件分析并构建系统进化树和氨基酸序列同源性表。结果表明。RC株的VP60基因大小为506bp,GC含量为56．35％．与其它16株RHDVVP60基因核苷酸序列的同源性较高,最高达98.2％;而氨基酸序列的同源性达80％左右。     

一株无血凝性兔出血症病毒的分离鉴定及其衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒（RHDV），命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性；但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成清晰的沉淀线；电镜观察可见30nm左右的病毒粒子。采用RT-PCR方法将Yaan-1株的衣壳蛋白VP60基因进行了克隆测序，序列分析表明VP60基因序列全长1740bp，编码579个氨基酸，测序结果提交GenBank（注册号为DQ069280），并与世界各国的常规RHDV分离株进行比较，结果表明核苷酸同源性为90．0％～98．0％，氨基酸同源性为94．1％～99．0％，氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区；同时对Yaan-1株的分子量、等电点、疏水性、跨膜区等分子结构特征进行了分析。本研究首次报道了无血凝性RHDV中国分离株，丰富了地方毒株资源，为明确我国地方株的分子流行病学，以及对VP60蛋白分子特征研究提供了新材料。     

ELISA验证兔铁蛋白重链与RHDV VP60相互作用

为验证本实验室前期实验中初步鉴定的兔铁蛋白重链(FTH)与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)具有相互作用关系,本研究采用RT-PCR技术从兔肝脏扩增编码FTH基因,并将其克隆至pET-32a(+)中转化大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS中进行表达.重组FTH蛋白(rFTH)经IPTG诱导获得表达,采用Ni-NTA Agarose纯化rFTH.利用纯化的VP60作为ELISA包被抗原检测FTH与VP60的相互作用.结果表明,ELISA检测的OD490nm值与FTH蛋白量呈正相关.本研究进一步验证了FTH与VP60具有相互作用关系.     

Egg yolk IgY against RHDV capsid protein VP60 promotes rabbit defense against RHDV infection

VP60 capsid protein is the major structural and immunogenicity protein of RHDV (Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV), and has been implicated as a main protein antigen in RHDV diagnosis and vaccine design. In this report, egg yolk antibody (IgY) against N-terminal of VP60 was evaluated and developed as a new strategy for RHDV therapy. Briefly, N-terminal of VP60 (～250aa) fragment was cloned and inserted into pET28a expression vector, and then the resultant plasmid, pET28a/VP60-N, was transformed into E. coli BL21(DE3) for recombinant VP60-N protein (rVP60-N) expression. Next, the rVP60-N was purified by Ni⁺-affinity purification chromatography and identified by Western blotting with RHDV antiserum. After immunizing the chickens with rVP60-N, the anti-rVP60-N IgY was isolated, and the activity and specificity of the IgY antibody were analyzed by ELISA and Western blotting. In our results, the rVP60-N could be expressed in E. coli as soluble fraction, and the isolated anti-rVP60-N IgY demonstrated a high specificity and titer (1:22,000) against rVP60-N antigen. For further evaluation of the IgY efficacy in vivo, rabbits were grouped randomly and challenged with RHDV, and the results showed that anti-rVP60-N IgY could significantly protect rabbits from virus infection and promote the host survival after a sustained treatment with anti-rVP60-N IgY for 5 days. Taken together, our study demonstrates evidence that production of IgY against VP60 could be as a novel strategy for the RHDV therapy.     

兔出血症病毒JL株分离鉴定及VP60基因主要抗原表位分析

采用血凝试验、电镜观察、RT－PCR方法分离鉴定了1株JL株兔出血症病毒（RHDV）,扩增衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMDl8－T载体上,经酶切鉴定后测序。结果显示,VP60基因全长1740bp,编码580个氨基酸;JL株与其他RHDV分离株比较,核苷酸同源性为93．7％－99．2％,氨基酸同源性在97．3％－99．5％,在VP606个区中,A、B、D、F是稳定区,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;将JL株与国内外标准株蛋白氨基酸变畀及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行比较分析,预测RHDV VP60细胞表位。     

猪体内筛选RHDV VP60 T细胞表位的优势区

应用戊二醛醛化的人＂O＂型红细胞纯化兔出血症病毒（RHDV）,对非免猪进行3次免疫后,分离外周血淋巴细胞经不同段重组杆状病毒（共分5段表达）、纯化的病毒、Con A刺激后进行IFN-γ、IL-2、IL-4、WST检测。结果显示,纯化病毒的血凝效价为28,与未纯化的RHDV毒价相差1个滴度;WST检测结果为免疫组经3段重组杆状病毒刺激的值最高;IFN-γ和IL-2检测结果也是3段重组杆状病毒刺激的值最高;IL-4检测结果为3段重组杆状病毒刺激的值最低。由此表明病毒经纯化后效果好,3段重组杆状病毒区域为T细胞表位优势区,这为RHDV T细胞表位的进一步研究奠定基础。     

兔出血症病毒TP株VP60基因DNA免疫小鼠的实验研究

为评价兔出血症病毒(RHDV)VP60基因在小鼠体内诱导产生体液免疫和细胞免疫情况,本研究构建了RHDV VP60基因的真核表达质粒pcDNA-VP60,并将其免疫小鼠。利用ELISA方法检测特异性抗体和小鼠外周血细胞因子水平,MTT法和流式细胞术(FACS)检测小鼠外周血T淋巴细胞增殖情况和T淋巴细胞亚群的动态变化。抗体检测结果显示,重组质粒免疫组抗体水平在免疫后5周～6周达到峰值,而且与对照组比较差异显著(p<0.05);细胞因子检测结果显示,重组质粒免疫组血清中IFN-γ、IL-2、IL-4因子水平随免疫时间延长而升高,并且能够维持较高水平,与对照组比较差异显著(p<0.05);T淋巴细胞检测结果显示,重组质粒免疫组T淋巴细胞明显增殖,CD4+T淋巴细胞数量免疫后明显增高,与对照组比较差异显著(p<0.05);所有检测指标显示重组质粒免疫组和灭活苗免疫组比较均无显著差异(p>0.05)。以上结果表明pcDNA-VP60重组质粒可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫,为研制预防兔病毒性出血症的候选DNA疫苗提供了实验依据。