抗新城疫病毒HN蛋白单链抗体的原核表达及其功能鉴定

为制备抗鸡新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)单链抗体(scFv)并鉴定其生物学功能,本研究提取抗NDV HN单克隆抗体杂交瘤细胞株总RNA,通过RT-PCR扩增抗HN蛋白抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)编码序列,将其插入含有Linker序列的载体pET-scIG中,构建抗HN的scFv(HN-scFv)原核表达重组质粒pET-HN-scFv并在大肠杆菌中诱导表达。结果显示HN-scFv主要以包涵体形式存在。将包涵体进行复性和Ni-NTA层析柱纯化后用于流式细胞仪检测,结果显示复性纯化后的HN-scFv能够识别表达于293T细胞表面的NDV HN蛋白。该scFv的制备为进一步对该抗体进行改造奠定了基础。     

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A单克隆抗体的制备及其靶位点区域的鉴定

为制备非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(NMHC-II A)的单克隆抗体(MAb),本研究将编码NMHC-Ⅱ A羧基端1 651～1 960氨基酸的表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞Rosseta中诱导表达,重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG 4000介导融合。ELISA方法检测筛选阳性杂交瘤细胞,制备腹水并纯化MAb,以间接免疫荧光和免疫沉淀方法鉴定MAb的特异性,western blot检测MAb靶位点区域。结果表明,通过筛选得到1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系,其抗体亚型为IgG1,细胞培养上清和腹水效价分别为1∶2 560和1∶1.0×106;该MAb能够特异性结合相应抗原,并结合Marc-145细胞;western blot结果显示该抗体与NMHC-Ⅱ A的1 812～1 894氨基酸位点结合。该抗体的制备为研究NMHC-Ⅱ A在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞中的作用奠定了基础。     

抗猫细小病毒嵌合抗体基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

为降低单克隆抗体(MAb)在犬体内的免疫原性,本研究克隆了具有中和猫、犬细小病毒(FPV、CPV)活性的MAb(3EB)的轻、重链可变区基因及犬天然抗体(NAb)轻、重链恒定区基因,通过融合PCR获得鼠-犬嵌合抗体基因。构建能够表达嵌合抗体的重组质粒,经昆虫杆状病毒表达系统对重组嵌合抗体进行表达。SDS-PAGE和western blot试验显示鼠-犬嵌合抗体重链为55ku、轻链为25ku。间接免疫荧光试验显示该嵌合抗体能够与抗犬IgG和FPV特异性结合。上述结果表明,嵌合抗体保留了原MAb3EB对病毒特异结合能力的基础上,将鼠源恒定区替换为犬源NAb的恒定区。病毒中和试验表明嵌合抗体保留了3EB对FPV、CPV的中和活性。本研究首次通过昆虫杆状病毒表达系统表达了抗FPV、CPV的嵌合抗体,降低了原MAb的免疫原性,对FPV、CPV病临床治疗用抗体药物的研制具有重要指导意义。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白分段表达及其生物学功能的鉴定

为进一步研究PRRSV GP5蛋白的生物学功能,本研究将已分离的PRRSV北美洲型野毒株TA-12的GP5基因分为4段(79 bp～207bp、133bp～330bp、229bp～492bp和382bp～603bp)分别克隆于pGEX-6p-1中,并转化E.coli BL21(Rosetta)细胞进行诱导表达.表达蛋白经纯化后,以间接荧光方法(IFA)检测它们与Marc-145细胞的相互作用.IFA检测结果表明GST-GP5-1和GST-GP5-2融合蛋白均能够与Marc-145细胞结合,而且其结合位点在27aa～110aa区域.本实验为进一步研究GP5蛋白生物学功能提供试验依据.     

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A羧基端蛋白的真核表达及在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞中的作用

前期研究结果证明抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的抗独特型抗体特异性结合Marc-145细胞上的非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A,NMHCⅡ-A)蛋白,其结合位点位于NMHCⅡ-A的羧基端。本研究通过真核表达NMHCⅡ-A的羧基端(PRA)蛋白,验证其对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达PRA蛋白。Western blot和间接免疫荧光鉴定PRA蛋白的表达及其与Marc-145细胞的结合。通过病毒中和试验、荧光聚焦中和试验和荧光定量PCR检测PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。Western blot和间接免疫荧光结果表明,PRA蛋白在真核细胞中得到成功表达,其最高表达量为接种1个MOI杆状病毒后96h时。PRA蛋白特异性结合Marc-145细胞,使PRRSV感染Marc-145细胞延迟24h并且感染效率降低60%。真核表达的NMHCⅡ-A羧基端蛋白能特异性结合Marc-145细胞并有效降低PRRSV的感染。这些结果为进一步阐明NMHCⅡ-A在PRRSV感染细胞过程中的作用提供了新的依据。     

抗新城疫病毒HN蛋白单链抗体基因的克隆与序列分析

从分泌抗新城疫HN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取纯化mRNA,经RT-PCR扩增抗体轻、重链可变区基因,然后与L inker连接组装成单链抗体基因(scFv),其排列方式为VL-linker-VH。结果,成功地构建了scFv基因,序列分析表明,scFv基因长为744 bp,其中VH基因长为366 bp,VL基因长为333 bp。单链抗体基因的构建为抗新城疫HN蛋白基因工程抗体的制备奠定了基础。     

抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体的构建及初步鉴定

为了构建鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(N)单链抗体(scFv),本研究通过提取杂交瘤细胞株6H3的总mRNA,采用RT-PCR法扩增出抗IBV N蛋白抗体的重链和轻链可变区基因,利用重叠延伸PCR将其重链和轻链通过一条寡核苷酸链连接起来扩增了单链抗体基因,并将其克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组质粒,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.对表达产物进行纯化复性后,用夹心ELISA和western blot检测表明scFv可与传染性支气管炎病毒核蛋白发生特异性结合.     

抗诺氟沙星噬菌体单链抗体库的构建与筛选

应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗诺氟沙星(NFLX)单链抗体库,筛选获得抗NFLX高特异性、高亲和力的单链抗体scFv。将NFLX与BSA化学偶联获得的免疫源,免疫Balb/C小鼠,提取脾细胞RNA,反转录获得cDNA。以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的特异性引物,扩增获得VH基因和VL基因。通过SOE-PCR法将VH基因和VL基因通过柔性多肽Linker((Gly4Ser)3)拼接成VH-Linker-VL片段,酶切(sfiⅠ+NotⅠ)处理后,插入噬粒载体pCANTAB5E,并转化宿主菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建抗NFLX噬菌体单链抗体库。以包被抗原NFLX-OVA包被96孔板,亲和富集法,经三轮淘筛,间接Elisa初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。成功构建噬菌体单链抗体库,获得鼠源抗NFLX特异性的scFv,噬菌体中scFv插入率为90%,获得库容约为1.3×106的抗NFLX噬菌体单链抗体库,筛选得到5株抗NFLX的scFv。为运用噬菌体展示抗体技术制备特异性抗药物单抗及进一步建立药残检测新技术奠定了基础。     

抗脂肪细胞特异膜蛋白单链抗体基因的克隆及序列分析

从分泌抗40ku脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取纯化mRNA，经RT—PCR扩增抗体轻、重链可变区基因，然后与Linker连接组装成单链抗体基因(scFv)。结果，成功地构建了scFv基因，其排列方式为VH—linker—VL。经序列分析表明，scFv基因全长741bp，VH基因全长369bp，VL基因全长327bp。抗脂肪细胞膜蛋白单链抗体基因的构建为进行该抗体基因的表达奠定了基础。     

表达PRRSV N蛋白稳定细胞系的构建与鉴定

旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板，通过PCR扩增N基因，并将其克隆到慢病毒载体中，获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞，嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因，通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系，为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。     

稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定

试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功。     

Establishment and Identification of One Marc-145 Cell Line Stably and Highly Expressing Porcine CD163

This study was attempted to generate one Marc-145 cell line stably and highly expressing porcine CD163 (pCD163) and set the foundation for PRRSV isolation and vaccine production.CD163 was shown to be a cellular receptor capable of mediating infection of PRRSV non-permissive cell lines.The pCD163 gene was amplified by RT-PCR from porcine alveolar macrophages and cloned into the eukaryotic expression vector pCI-neo, then the positive plasmid pCI-pCD163 was transfected into Marc-145 cells.After selecting with G418 and subcloning for 3 times, Marc-145 cell line expressing pCD163 was established.IFA results indicated that the fluorescence of pCD163-Marc cells was significantly brighter than Marc-145 cells;Western blotting results indicated that the pCD163-Marc cells could express higher levels of CD163 and the expression level was 8.7 times higher than Marc-145 cells.The pCD163-Marc cell line could be stably passaged for 20 passages and the expression level of CD163 was similar with different passages, which would be a valuable tool for facilitating virus propagation and vaccine production.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7片段互换嵌合病毒的构建及其生物学特性的分析

为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)强弱毒之间毒力差异的分子基础,本实验分别以HP-PRRSV强毒HuN-F5株及其传代致弱的疫苗病毒株HuN4-F112为亲本病毒,利用反向遗传操作技术分别将ORF1a、ORF1b或ORF2-7编码序列在强弱毒之间互换。将6种含有不同嵌合基因的全长病毒基因组的重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中传代,拯救的重组病毒经RT-PCR、测序和免疫荧光鉴定,并分别命名为rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7(以强毒为骨架)和rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7(以弱毒为骨架)。进一步测定这些病毒在Marc-145上的生长曲线,结果显示:以强毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著高于亲本强毒rHuN4-F5,而以弱毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F112-ORF1a在细胞上的生长滴度低于其亲本弱毒rHuN4-F112,其他片段替换对病毒在细胞上的生长没有明显影响。本实验结果提示ORF1a对于PRRSV在体外细胞培养上的生长调节起重要作用。     

Effect of virus-specific antibodies on attachment, internalization and infection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in primary macrophages

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) induces respiratory distress in young pigs and reproductive failure in sows. In PRRSV infected pigs, virus persists for several weeks to several months. Although IPMA antibodies are detected from 7 days post inoculation (pi), virus neutralizing (VN) antibodies are commonly detected starting from 3 weeks pi with an SN test on Marc-145 cells. Since infection of Marc-145 cells is quite different compared to infection of macrophages, the in vivo target cell, the role of these VN antibodies in in vivo protection is questionable. In our study, we demonstrated that antibodies from pigs early in infection with PRRSV Lelystad virus (14 days pi) showed no neutralization in the SN test on Marc-145 cells, but partially reduced Lelystad virus infection of porcine alveolar macrophages. At 72 days pi, VN antibodies were detected by the SN test on Marc-145 cells, and these protected macrophages completely against Lelystad virus infection. In contrast, these VN antibodies only partially reduced porcine alveolar macrophage infection of a Belgian PRRSV isolate (homologous virus), and had no effect on infection of porcine alveolar macrophages with the American type VR-2332 strain (heterologous virus). Confocal analysis of Lelystad virus attachment and internalization in macrophages showed that antibodies blocked infection through both a reduction in virus attachment, and a reduction of PRRSV internalization. Western immunoblotting analysis revealed that sera from 14 days pi, which showed no neutralization in the SN test on Marc-145 cells but partially reduced Lelystad virus infection of macrophages, predominantly recognized the Lelystad virus N protein, and reacted faintly with the M envelope protein. Sera from 72 days pi, with VN antibodies that blocked infection of Marc-145 cells and PAM, reacted with the N protein and the two major envelope proteins M and GP5. Using the Belgian PRRSV isolate 94V360 an identical but less intense reactivity profile was obtained. VN sera also recognized the VR-2332 N and M protein, but not the GP5 protein.     

免疫抗体压力下PRRSVGD株Nsp2和GP5基因变异分析

以PRRSVGD-2007株为材料,在自然条件和抗体压力下连续传至40代后,分别命名为PRRSV—GD—f40和PRRSV—GDAb—f40,进行RT—PCR,扩增Nsp2基因部分序列和GP5基因全长,克隆并测序。应用序列分析软件将测序结果和已经发表的PRRSV毒株进行比对,结果显示：Nsp2基因扩增片段大小均为796bp,自然传代和抗体压力下传代后的新毒株和母源毒株的相似性分别为98．0％和97．9％;扩增的GP5基因大小为603bp,编码200个氨基酸,和母源毒株的相似性分别为99．2％和98．8％。     

稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系的构建

为了构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的Marc-145细胞系,以PRRSV全长感染性克隆为模板,通过PCR方法扩增PRRSV N基因,将N基因克隆到慢病毒载体中,获得重组质粒pLenti-CMV-N,利用三质粒慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,将慢病毒颗粒转导至Marc...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪IL-18基因共表达真核表达系统的建立

采用RT-PCR方法扩增了JL/07/SW毒株GP5蛋白和猪IL-18基因。将该基因克隆入真核表达载体pEG-FP-N1,获得重组质粒pEGFP-GP5和pEGFP-IL18-GP5。将重组质粒转染Marc-145细胞,通过Western blotting和green fluorescent检测产物的表达情况。结果显示,所构建的2个重组质粒在Marc-145细胞中能进行有效的转录。结果表明,所构建的重组质粒pEGFP-GP5和pEGFP-IL18-GP5在Marc-145细胞中得到表达,为进一步研究PRRSV基因工程疫苗奠定了基础。     

牛A群轮状病毒G10型XJ-2022株分离鉴定及基因型分析

【目的】 试验旨在对新疆某规模牛场患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定及基因型分析。【方法】 采用抗原诊断试剂盒方法对在新疆某牛场随机采集的15份腹泻犊牛粪便样品进行检测,对抗原检测结果为阳性的样品进行反复冻融和过滤处理,然后将样品接种于Marc-145细胞进行病毒的分离和传代。对分离毒株进行间接免疫荧光试验（IFA）和负染电镜观察进一步确定病原。对分离株的VP6和VP7基因进行PCR扩增测序,并对其进行基因相似性比对和进化树分析。【结果】 抗原诊断试剂盒结果显示,3份粪便样品呈牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）抗原阳性。将阳性粪便样品分别接种于Marc-145细胞,仅有1份样品连续盲传至第9代出现明显的细胞病变效应（CPE）。IFA结果显示,接种该分离株的Marc-145细胞有亮绿色荧光,对照组未见荧光。电镜观察可见约65 nm的圆形病毒粒子,并命名为XJ-2022株。经PCR扩增获得VP6和VP7基因的目的条带,长度分别为1 356和342 bp。基因相似性比对和遗传进化分析表明,VP6基因与人源A群轮状病毒参考株DB2015-066（LC367318.1）相似性最高且遗传进化亲缘关系最近;VP7基因与牛源G10轮状病毒参考株XJX2（MN937506.1）相似性最高,遗传进化亲缘关系最近,确定该分离株为A群G10型轮状病毒。【结论】 试验成功分离到基因型为A群G10型BRV XJ-2022株,该毒株为新疆地区首次发现的多宿主来源的基因重配病毒。