暗纹东方鲀组织内TTX含量与钠离子通道基因表达特征分析

为了探究暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）组织内TTX含量与含毒组织电压门控钠离子通道基因表达特征。分别采用酶联免疫法（ELISA）测定暗纹东方鲀肝脏、心脏等8个组织 TTX含量,实时荧光定量(RT-qPCR)方法检测电压门控钠离子通道α亚基基因家族成员scn1aa,scn1ab,scn4aa,scn4ab,scn5aa,scn5ab,scn8aa,scn8ab（以下简称“电压门控钠离子通道基因”）在各组织中的相对表达特征。结果显示：各组织中TTX含量由高到低为脑(9.521±2.816μg/g)、心脏(4.271±1.129μg/g)、鳃(1.586±0.527μg/g)、肌肉(1.494±0.938μg/g)、肝脏(0.913±0.206μg/g)、皮肤(0.902±0.235μg/g)、肠道(0.894±0.215μg/g)和眼(0.864±0.287μg/g),脑、心脏组织为弱毒性,肝脏、皮肤、肌肉、眼、肠道、鳃组织为微毒性。RT-qPCR结果显示scn1aa、scn1ab、scn4ab、scn5aa、scn8aa、scn8ab基因均在肝脏组织的相对表达量最高,scn4aa基因仅在肌肉组织表达,皮肤组织仅有scn4ab基因表达,且scn4ab基因在所有检测组织种均有表达,表达具有广泛性。钠离子通道基因在斑马鱼和暗纹东方鲀组织表达特征存在差异。scn4ab基因可能在东方鲀属鱼类耐受TTX分子基础中发挥重要作用。     

桔小实蝇电压门控钠离子通道基因cDNA克隆及其生物信息学分析

【目的】克隆获得桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）电压门控钠离子通道基因cDNA序列,明确其典型特征,为研究桔小实蝇抗性分子机理奠定基础。【方法】采用RT-PCR和PCR技术,克隆桔小实蝇钠离子通道基因cDNA序列,利用相关软件对其序列进行生物信息学分析。【结果】克隆得到1条长为6 446 bp的cDNA序列,包含1个6 405 bp的完整开放阅读框,共编码2 134个氨基酸。同源比对发现,桔小实蝇与果蝇（Drosophila melanogaster,NP_001188635）和家蝇（Musca domestica,AAB47604）钠离子通道基因相似度分别高达91.7%和86.9%,而与人的钠离子通道Nav1.2基因（Homo sapiens,NP_066287）相似度为42.3%。所克隆序列包含昆虫钠离子通道所有典型特征。【结论】成功地从桔小实蝇中克隆得到钠离子通道基因完整开放阅读框。该钠离子通道基因存在丰富的选择性剪接,发现了3个可能与抗性相关的碱基取代。钠离子通道基因有可能发展成为一种昆虫系统发育研究的分子标记。     

昆虫钠离子通道抑制剂的应用研究进展

电压敏感的钠离子通道是神经细胞兴奋传导的基础,也是神经毒性杀虫剂最主要的作用靶标。为此,综述了昆虫钠离子通道抑制剂滴滴涕及其类似物、拟除虫菊酯类、吡唑类、二苯基甲醇哌啶类、藜芦碱类、N-烷基酰胺类杀虫剂及其他生物毒素的应用研究进展,并对其开发前景进行了展望。     

Cilp基因对斑马鱼肌间骨和脊椎发育的影响

为阐明cilp基因在斑马鱼椎骨和肌间骨发育中的作用,利用CRISPR/Cas9建立了斑马鱼cilp基因敲除纯合突变系（cilp-/-）,对其进行了骨骼表型的观察,并进一步采用qRT-PCR分析了14个骨骼发育相关基因在突变体胚胎发育阶段和成鱼骨骼中的表达水平变化。结果显示,与野生型斑马鱼相比,90 dph（days post hatched）cilp-/-斑马鱼的肌间骨数量显著减少了10.27%（P<0.05）,而肌间骨的长度无明显变化;同时突变体斑马鱼中椎骨发生异常融合及髓棘缺失。qRT-PCR结果显示,与野生型相比,col1a1a、sp7、smad4a和smad5基因在胚胎发育的整个时期都存在显著的差异（P<0.01）;在突变体成鱼尾部骨骼组织中bmp2a、bmp2b、smad5、sp7、runx2a、runx2b和bglap基因的表达量均显著低于野生型,表明cilp基因敲除导致了BMPs和SMADs家族基因的表达水平下降,并下调了下游的成骨细胞发育相关基因的表达量,推测cilp功能缺失可能通过抑制BMPs信号通路,影响成骨细胞分化和骨形成,从而导致了肌间骨数量的减少和脊椎骨异常融合。     

斑马鱼nos2a基因的生长调控作用

鱼类的生长调控一直是水产领域研究的热点。为了在斑马鱼中探索诱导型一氧化氮合酶（Nos2）在生长调控中的作用，我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，首次构建了可稳定遗传的nos2a缺失型（nos2a-/-）斑马鱼家系。通过监测其生长过程发现，nos2a-/- 斑马鱼的整体生长趋势较nos2a正常型（nos2a+/+）斑马鱼偏低，且nos2a-/-成鱼的体型显著小于同期的nos2a+/+ 斑马鱼（P <0.01）：nos2a+/+成鱼体长（29.53 ± 0.60） mm，nos2a-/-成鱼体长（26.34 ± 0.69） mm；nos2a+/+成鱼体质量（512.8 ± 30.75） mg，nos2a-/-成鱼体质量（394.4 ± 16.91） mg。而在肌纤维密度（P =0.718）及躯椎骨的横截面积上（P =0.548）两者没有显著差异。qPCR检测发现，出膜8天时，nos2a-/- 斑马鱼的生长激素基因gh1的mRNA水平（P <0.01）及类胰岛素生长因子基因igf1的mRNA水平（P <0.001）均显著低于nos2a+/+ 斑马鱼；出膜68天时，nos2a-/- 斑马鱼的gh1 （P <0.0001）和igf1 （P <0.0001）的mRNA水平同样显著低于nos2a+/+ 斑马鱼。以上结果表明，斑马鱼中nos2a的功能缺失导致鱼体生长受到抑制，而gh1及igf1 mRNA的水平下调是其潜在原因。     

氯虫酰胺对甜菜夜蛾神经元钠离子通道电流的影响

为了研究新型杀虫剂氯虫酰胺对甜菜夜蛾（Laphygma exigua）的杀虫机制,应用全细胞膜片钳技术记录了氯虫酰胺对急性分离的甜菜夜蛾幼虫中枢神经细胞电压门控钠离子通道的影响。结果显示,在电压钳模式下,0.1 g/L药物作用1 min、5 min、15 min后平均钠离子通道电流峰值分别是（-9.627±0.114）nA、（-11.668±0.131）nA、（-8.726±0.398）nA。在电流钳模式下,0.4 g/L药物作用1 min、3 min、5 min后动作电位峰值分别为（94.366±4.596）m V、（90.363±2.258） m V、（83.15±2.959）m V ,时程分别为（5.025±0.884）m s、（6.032±0.073） m s、（6.387±0.376） ms ,药物作用10 min后只能产生电紧张,无法发放动作电位。以上结果表明,氯虫酰胺对钠电流的作用明显具有时间依赖性,0.1g/L药物初始可增加钠离子通道电流峰值,但随用药时间延长效果减弱。高质量浓度氯虫酰胺可时间依赖性地降低动作电位峰值和延长时程,降低细胞膜兴奋性。甜菜夜蛾中枢神经细胞钠离子通道是氯虫酰胺药物的作用靶标之一。     

斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达

【目的】实现斑马鱼g型溶菌酶在大肠杆菌中表达,以获得高纯度且具溶菌活性的融合蛋白,为探究g型溶菌酶在斑马鱼抗菌过程中的作用机制及其开发利用打下基础。【方法】通过ClustalW、ExPASy、SignalP-5.0 Server及PSIPRED等在线软件对斑马鱼g型溶菌酶进行生物信息分析,经密码子优化后合成斑马鱼g型溶菌酶基因,亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,以IPTG进行诱导表达,并通过非干扰型蛋白浓度测定试剂盒和溶菌酶测定试剂盒（比浊法）测定其浓度及溶菌活性。【结果】从GenBank检索获得的斑马鱼溶菌酶基因g1（NM_001002706.1）和g2（XM_002664371.5）分别命名为Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。Zeb-Lys-g1基因开放阅读框（ORF）长591 bp,共编码196个氨基酸残基,其编码蛋白分子量约21.6 kD;Zeb-Lys-g2的ORF长576 bp,共编码191个氨基酸残基,其编码蛋白分子量约21.1 kD;2种斑马鱼g型溶菌酶序列中均含有2个半胱氨酸残基及3个保守的催化残基位点（Glu、Asp和Asp）。Zeb-Lys-g1的N端含有17个氨基酸的信号肽,而Zeb-Lys-g2不存在典型的信号肽结构,但其三级结构均具有多个α-螺旋结构。在基于溶菌酶序列相似性构建的系统发育进化树中,Zeb-Lys-g1序列与金鱼g型溶菌酶序列的亲缘关系最近,而Zeb-Lys-g2序列与鲈形目和鲽形目鱼类的g型溶菌酶序列亲缘关系较近。将合成的斑马鱼g型溶菌酶基因（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化BL21（DE3）感受态细胞,20 ℃下经IPTG（终浓度0.5 mmol/L）诱导16 h,可获得融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2,纯化后的浓度分别为1.01和1.66 mg/mL,对应的溶菌活性分别为689.68和44.39 U/mg。【结论】鱼类g型溶菌酶的基因变异较保守,经密码子优化及全基因合成方式合成的斑马鱼g型溶菌酶基因Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2可通过原核表达获得高纯度、高溶菌活性的融合蛋白,为探究斑马鱼溶菌酶的抗菌机制提供了技术支持。     

omd基因对斑马鱼骨骼矿化的影响

omd基因编码骨调蛋白,可以调控人类骨骼的矿化。目前关于omd基因对鱼类骨骼矿化的作用尚不清楚。为了探究omd基因对鱼类骨骼的影响,调查了omd基因在斑马鱼不同发育阶段和不同组织的表达,并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功构建斑马鱼omd基因突变体（omd-/-）。结果表明：omd基因在斑马鱼体内随着发育表达量逐渐增加,在脊柱和肌肉中表达较高;相比野生型斑马鱼,omd-/-品系斑马鱼的骨骼形态和尾部肌肉结构未发现明显变化,脊柱的钙含量下调59.81%;与野生型相比,omd-/-纯合敲除品系斑马鱼平均游泳距离下降33.93%,平均游泳速度下降39.44%,相对静止的时间增加88.26%,游泳能力下降。这些结果表明,omd基因缺失影响斑马鱼脊柱的矿化,并在一定程度上影响了斑马鱼的活动能力。     

斑马鱼软骨内骨化过程中骨骼的转录组测序分析

为研究斑马鱼(Danio rerio)骨骼发育时期关键调控基因及复杂的调控网络,采用阿尔辛蓝-茜素红双重染色方法对受精后50 d(day post fertilization, dpf)和65 dpf野生型斑马鱼骨骼进行染色,提取50 dpf和65 dpf斑马鱼骨骼的总RNA进行转录组测序,对差异表达基因进行筛选并进行GO功能注释和KEGG富集分析。结果表明：50 dpf斑马鱼头骨正在经历软骨内骨化,而65 dpf斑马鱼软骨内骨化过程基本完成;对50 dpf与65 dpf斑马鱼骨骼进行转录组测序,共产生41.44×10⁹个有效数据,存在610个差异表达基因,相比50 dpf斑马鱼,65 dpf斑马鱼骨骼中软骨发育相关基因(dlx2a、foxd3和sec23b)、骨矿化调节基因(ptk2bb)、骨骼细胞分化正调控基因(dlx2a)均下调,表明其骨骼发育已较为成熟,骨细胞分化过程减少,与阿尔辛蓝-茜素红双重染色结果相一致;进一步对这些差异表达基因进行GO功能注释和KEGG富集分析,发现大部分差异表达基因与代谢网络、生殖信号通路相关;随机选取了6个差异表达基因进行实时荧...     

somatostatin1基因突变斑马鱼仔鱼转录组分析

生长抑素（Somatostatin,SST）是一类神经激素多肽,对脊椎动物的生长和代谢起着关键的调控作用。在斑马鱼（Danio rerio）和其它鱼类中,生长抑素由6个基因编码（sst1-sst6）,sst1存在于所有脊椎动物中,并且在进化上最为保守。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在斑马鱼中构建了可稳定遗传的生长抑素基因sst1突变体鱼系。通过比较6 dpf（days post fertilization,dpf）的sst1-/-突变体和野生型仔鱼转录组,发现sst1-/-突变体相关生化过程和信号通路发生了显著变化。相比野生型,sst1-/-突变体仔鱼中有354个基因显著上调,504个基因显著下调。GO（Gene ontology）富集分析表明,大部分差异基因与氨基酸和蛋白质生物合成相关。KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集显示代谢通路、氨基酸合成、氨基酰基- tRNA合成、核糖体合成和rRNA加工相关通路表达增强。结果表明,sst1-/-突变体蛋白质生物合成和代谢过程更加活跃。RT-qPCR验证结果显示,随机选取的10个基因mRNA表达变化趋势与转录组测序结果一致,说明转录组测序结果真实可靠。6月龄突变体体重体长和野生型相比并无显著差异。本研究结果为进一步挖掘生长抑素基因家族的潜在功能奠定基础。     

鲤KCTD15基因的克隆和表达

通过克隆得到鲤Cyprinus carpio含钾离子通道四聚化结构域15 (KCTD15)两个基因KCTD15a和KCTD15b,其开放阅读框(Open read frame,ORF)均为774 bp,编码含257个氨基酸的多肽,编码的蛋白质相对分子量均为29 000,PI分别为7.0和6.5.经氨基酸比对和进化树分析表明:鲤KCTD15基因与斑马鱼Danio rerio、人Homo sapien、食蟹猴Macaca fascicularis、牛Bos taurus、小鼠Mus musculus、家鼠Rattus norvegicus、爪蟾Xenopus laevis等的KCTD15基因具有高度同源性,均含有一个BTB(Broad-Complex,Tramtrack and Bric a brac)模块,鱼类比哺乳动物少26个氨基酸.采用半定量RT-PCR法分析了KCTD15基因在鲤组织中的表达,结果表明:KCTD15a基因只在头肾中表达且较低,在其他组织中均不表达;KCTD15b基因在卵巢中表达最高,在鳃和皮肤中次之,在脑、肝胰脏、头肾、肠等组织中表达较低.采用实时荧光定量PCR法检测KCTD15在鲤胚胎发育时期的表达,结果表明:KCTD15a和KCTD15b基因都在受精后0h表达量最高(P＜0.05),在受精后6h和12 h均迅速下降(P＜0.05);KCTD15a基因在受精后36 h有所上升,但未达到6h的水平,在受精后72 h及破膜后3d、10 d时表达量逐渐降低;而KCTD15b基因在受精后36 h降至最低,在受精后72 h及破膜后3d时逐渐升高,但幅度不大,破膜后10 d时再次下降;KCTD15b基因的表达量总体高于KCTD15a基因的表达量.     

Ionic mechanisms of cholinergic excitation in molluscan neurons

Acetylcholine appears to be an excitatory transmitter at synapses on two different types of molluscan nerve cells: the so-called D- and CILDA neurons. The action of this substance is different in the two cases. In D-neurons, this compound increases the permeability of the subsynaptic or somatic membrane to chloride ions, and through a net efflux of this anion, depolarizes the cell. In CILDA neurons, on the other hand, acetylcholine depolarzies the cell by increasing its permeability to sodium ions.     

支配山羊胸腺的神经纤维起源

用ＨＲＰ法研究证明,支配山羊胸腺的初级传入神经来源于双侧Ｃ１～Ｔ５ 脊神经节,以同侧为主;其标记神经元的分布呈双峰型;在双侧结状节也出现少量标记细胞,山羊胸腺的感觉经两侧神经传入,以交感途径占优势;交感节后纤维来自双侧颈前节、颈中节、星状节及Ｔ２～Ｔ５ 椎旁节,其中颈中节和星状节的标记细胞最多;在双侧Ｃ１～２节脊髓腹角和延髓疑核出现标记细胞较多,延髓迷走神经背核、面后核和脊上核出现较少的标记细胞。     

Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites

Vesicular glutamate transporters (VGLUTs) 1 and 2 show a mutually exclusive distribution in the adult brain that suggests specialization for synapses with different properties of release. Consistent with this distribution, inactivation of the VGLUT1 gene silenced a subset of excitatory neurons in the adult. However, the same cell populations exhibited VGLUT1-independent transmission early in life. Developing hippocampal neurons transiently coexpressed VGLUT2 and VGLUT1 at distinct synaptic sites with different short-term plasticity. The loss of VGLUT1 also reduced the reserve pool of synaptic vesicles. Thus, VGLUT1 plays an unanticipated role in membrane trafficking at the nerve terminal.     

Electrophysiologic responses in hamster superior colliculus evoked by regenerating retinal axons

Autologous peripheral nerve grafts were used to permit and direct the regrowth of retinal ganglion cell axons from the eye to the ipsilateral superior colliculus of adult hamsters in which the optic nerves had been transected within the orbit. Extracellular recordings in the superior colliculus 15 to 18 weeks after graft insertion revealed excitatory and inhibitory postsynaptic responses to visual stimulation. The finding of light-induced responses in neurons in the superficial layers of the superior colliculus close to the graft indicates that axons regenerating from axotomized retinal ganglion cells can establish electrophysiologically functional synapses with neurons in the superior colliculus of these adult mammals.     

Synaptic facilitation: long-term neuromuscular facilitation in crustaceans

Continuous stimulation at frequencies equal to or greater than 5 hertz for 20 to 30 minutes results in a two- to fivefold increase in the amplitudes of excitatory postsynaptic potential recorded from certain stretcher and opener muscles of decapod crustaceans. This long-term facilitation appears to result from an accumulation of sodium ions within the nerve terminals. It persists for at least 1 hour after stimulation has stopped.     

A voltage sensor-domain protein is a voltage-gated proton channel

Voltage-gated proton channels have been widely observed but have not been identified at a molecular level. Here we report that a four-transmembrane protein similar to the voltage-sensor domain of voltage-gated ion channels is a voltage-gated proton channel. Cells overexpressing this protein showed depolarization-induced outward currents accompanied by tail currents. Current reversal occured at equilibrium potentials for protons. The currents exhibited pH-dependent gating and zinc ion sensitivity, two features which are characteristic of voltage-gated proton channels. Responses of voltage dependence to sequence changes suggest that mouse voltage-sensor domain-only protein is itself a channel, rather than a regulator of another channel protein.     

鸡颈皮神经的感觉神经元和交感节后神经元—HRP法研究

此项研究用了体重1.0～2.5kg的成年母鸡18只,以追寻鸡颈皮神经的感觉神经元和交感节后神经元。将C_6～C_(11)皮神经断端浸渍于20％HRP溶液中2～3天以引入酶。取相应的颈交感干神经节和脊神经节及其前后相邻的神经节,制成厚50μm的连续冰冻切片。TMB反应,明视野光镜观察。标记的交感节后神经元胞体出现于与酶引入皮神经相连的交感干神经节。少数出现于相邻的后一个交感神经节。标记的脊神经感觉神经元胞体只出现于与酶引入皮神经相连的脊神经节。     

Subthalamic GAD gene therapy in a Parkinson's disease rat model

The motor abnormalities of Parkinson's disease (PD) are caused by alterations in basal ganglia network activity, including disinhibition of the subthalamic nucleus (STN), and excessive activity of the major output nuclei. Using adeno-associated viral vector-mediated somatic cell gene transfer, we expressed glutamic acid decarboxylase (GAD), the enzyme that catalyzes synthesis of the neurotransmitter GABA, in excitatory glutamatergic neurons of the STN in rats. The transduced neurons, when driven by electrical stimulation, produced mixed inhibitory responses associated with GABA release. This phenotypic shift resulted in strong neuroprotection of nigral dopamine neurons and rescue of the parkinsonian behavioral phenotype. This strategy suggests that there is plasticity between excitatory and inhibitory neurotransmission in the mammalian brain that could be exploited for therapeutic benefit.     

Glutamatergic and dopaminergic neurons mediate anxiogenic and anxiolytic effects of CRHR1

The corticotropin-releasing hormone receptor 1 (CRHR1) critically controls behavioral adaptation to stress and is causally linked to emotional disorders. Using neurochemical and genetic tools, we determined that CRHR1 is expressed in forebrain glutamatergic and γ-aminobutyric acid-containing (GABAergic) neurons as well as in midbrain dopaminergic neurons. Via specific CRHR1 deletions in glutamatergic, GABAergic, dopaminergic, and serotonergic cells, we found that the lack of CRHR1 in forebrain glutamatergic circuits reduces anxiety and impairs neurotransmission in the amygdala and hippocampus. Selective deletion of CRHR1 in midbrain dopaminergic neurons increases anxiety-like behavior and reduces dopamine release in the prefrontal cortex. These results define a bidirectional model for the role of CRHR1 in anxiety and suggest that an imbalance between CRHR1-controlled anxiogenic glutamatergic and anxiolytic dopaminergic systems might lead to emotional disorders.