BADH/pepB双价基因无选择标记表达载体转化苜蓿的初步研究

选用公农1号紫花苜蓿,以5～7d莆龄的无菌子叶为外植体,通过农杆菌介导法将含有甜菜碱醛脱氢酶(BADH)和酸性蛋白酶(pepB)双价基因的无选择标记表达载体导入苜蓿子叶中,并用含有Na2CO3和NaHCO3碱性盐溶液的培养基进行筛选,得到抗盐碱转化植株.碱性盐浓度48mmol/L宜于子叶愈伤诱导,有利于转化植株的获得.对转化植株进行PCR检测,初步证明目的基囚序列已经整合剑苜楷基因组中.移栽成活的13棵碱性盐抗性植株经PCR检测有3棵植株呈阳性.     

基因枪法将BADH基因转入羊草的研究

用PDS-1000He型基因枪将BADH基因转入由羊草成熟胚诱导出的胚性愈伤组织中,获得了转基因植株。通过Kanamycin筛选鉴定,优化了基因枪法转化羊草的各种参数。结果表明,DNA金弹到靶细胞的距离为9cm,每皿轰击1次时愈伤组织的瞬时表达率高达88.13%。转基因植株经PCR检测,初步证明外源基因已整合到羊草基因组中并得以表达。     

BADH／pepB双价基因无选择标记表达载体转化苜蓿的初步研究

选用公农1号紫花苜蓿,以5～7d苗龄的无菌子叶为外植体,通过农杆菌介导法将含有甜菜碱醛脱氢酶（BADH）和酸性蛋白酶（pepB）双价基因的无选择标记表达载体导入苜蓿子叶中,并用含有Na2CO3和NaHCO3碱性盐溶液的培养基进行筛选,得到抗盐碱转化植株。碱性盐浓度48mmol／L宜于子叶愈伤诱导,有利于转化植株的获得。对转化植株进行PCR检测,初步证明目的基因序列已经整合到苜蓿基因组中。移栽成活的13棵碱性盐抗性植株经PCR检测有3棵植株呈阳性。     

基因枪法将BADH基因转入羊草的研究

用PDS-1000He型基因枪将BADH基因转入由羊草成熟胚诱导出的胚性愈伤组织中，获得了转基因植株。通过Kanamycin筛选鉴定，优化了基因枪法转化羊草的各种参数。结果表明，DNA金弹到靶细胞的距离为9cm，每皿轰击1次时愈伤组织的瞬时表达率高达88．13％。转基因植株经PCR检测，初步证明外源基因已整合到羊草基因组中并得以表达。     

转BADH基因苜蓿T1代遗传稳定性和抗盐性研究

采用分子生物学检测和不同浓度的NaCl对转BADH基因苜蓿T1代2个株系进行遗传稳定性和抗盐性研究。结果表明,2个株系的T1代PCR阳性植株和阴性植株分离比例都符合孟德尔遗传规律;在0.8%NaCl胁迫下,转基因植株Northern杂交表达量明显增加,BADH酶活性和甜菜碱含量分别比对照植株增加2～4和4～5倍;不同浓度NaCl胁迫下转基因株系脯氨酸和可溶性糖含量、抗氧化酶活性都显著高于对照植株,而电导率和丙二醛含量显著低于对照植株。表明转入的BADH基因可以稳定遗传,转基因苜蓿植株耐盐性明显高于对照。     

草地早熟禾转CMO-BADH双基因和转CMO基因耐盐性分析

通过对非转基因草地早熟禾(Poa pratensis L.)、转CMO-BADH双基因草地早熟禾、转CMO基因草地早熟禾进行不同浓度的NaCl胁迫试验,测定其细胞膜的透性,丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、氧化氢酶(CAT)活性,评定各株系耐盐能力的强弱,同时还验证并比较了CMO-BADH双基因和CMO基因的耐盐性功能,为耐盐新品种的选育提供了理论依据。结果表明:所有株系的相对电导率、MDA含量均随盐浓度增加而增大,在NaCl胁迫下相对电导率和MDA含量的大小顺序为:非转基因株系>转CMO基因株系>转CMO-BADH双基因株系;在NaCl的胁迫下,各个株系的SOD活性、POD活性、CAT活性都有明显的提高,此3种指标的大小顺序为:转CMO-BADH双基因株系>转CMO基因株系>非转基因株系;综合考虑各个指标,各株系耐盐性强弱顺序为:转CMO-BADH双基因株系>转CMO基因株系>非转基因株系。     

我国饲料型四倍体刺槐研究进展

四倍体刺槐Robinia pseudoacacia自1997年引入我国以来,国内学者对其主要进行了如下几个方面的研究:1)不同地域不同立地条件下的适应性、生物量及叶片营养含量,肯定了饲料型四倍体刺槐的引种价值。2)常规和微繁育苗技术:常规育苗技术中的插根和嫁接繁殖技术已经成熟,达到了规模化生产的要求;微繁技术已找到了愈伤组织诱导及其分化为苗的培养基组合和培养条件以及组培苗的适宜移栽方式。3)抗盐基因遗传转化:已成功地将甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)转入四倍体刺槐,得到了15个抗盐植株,抗盐植株对NaCl的相对抗性提高了2‰~3‰。从引种、造林、微体快繁技术和遗传转化4个方面综述了这些研究成果,并探讨了存在的问题及可能的解决方法。     

基因苜蓿T1代遗传稳定性和抗盐性研究

采用分子生物学检测和不同浓度的ＮａＣｌ对转BADH基因苜蓿Ｔ１代２个株系进行遗传稳定性和抗盐性研究。结果表明,２个株系的Ｔ１代ＰＣＲ 阳性植株和阴性植株分离比例都符合孟德尔遗传规律;在０．８％ＮａＣｌ胁迫下,转基因植株Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交表达量明显增加,ＢＡＤＨ 酶活性和甜菜碱含量分别比对照植株增加２～４和４～５倍;不同浓度ＮａＣｌ胁迫下转基因株系脯氨酸和可溶性糖含量、抗氧化酶活性都显著高于对照植株,而电导率和丙二醛含量显著低于对照植株。表明转入的犅犃犇犎基因可以稳定遗传,转基因苜蓿植株耐盐性明显高于对照。     

农杆菌介导的匍匐翦股颖胚性愈伤组织的转化和转CBF1基因植株的获得

以匍匐翦股颖成熟胚诱导的胚性愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法就不同的菌液浓度、共培养条件和真空处理等对愈伤组织的转化效率进行研究.结果表明,适宜的农杆菌侵染浓度光密度OD600nm为0.8～1.2,真空处理加全光照的共培养条件有助于提高转化效率;CBF1基因是来源于拟南芥的与抗逆相关的转录因子基因,在匍匐翦股颖中实现了其转化,通过PCR检测,50株转基因植株中32株扩增出640bp的目标片断,部分转基因植株生长缓慢,表现出矮化性状.非胁迫条件下,转基因植株游离脯氨酸含量为对照的5倍.断水处理5d后,转基因植株生长基本正常,脯氨酸含量增加约2倍,比对照植株高2～3倍.     

农杆菌介导的PSAG12-IPT基因转化柳枝稷研究

为延长生物能源作物柳枝稷(Panicum virgatum)的叶片功能期,以柳枝稷‘西稷1号’品系的成熟胚诱导的愈伤组织为受体,采用农杆菌介导法转化叶片衰老延缓基因P_SAG12-IPT.结果表明:经过农杆菌转化,共培养,抗性愈伤组织筛选、再生和生根培养,在农杆菌介导处理的8500块愈伤组织中共获得了320株转化植株;经PCR检测分析,转化植株中共有19株植株扩增出标记基因潮霉素B磷酸转移酶基因的目标片段,初步表明P_SAG12-IPT基因已整合到柳枝稷基因组中,转化率为0.223%.对柳枝稷转基因植株的叶片叶绿素含量、净光合速率、胞间CO₂浓度和气孔导度进行测定,表明P_SAG12-IPT基因在部分转基因植株中已经表达.     

马铃薯ARF基因RNAi载体的遗传转化及对其试管薯生理特性的影响

用含有ADP核糖基化因子(ARF)基因的干扰载体的农杆菌转化马铃薯栽培品种“甘农薯2号”,获得转化植株48株,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测证明ARF基因已成功整合到马铃薯基因组中。用实时荧光定量PCR检测表明,转化植株中ARF基因的表达较对照均有不同程度的下降,在转基因株系Z-11和Z-12中,ARF基因表达的干扰程度分别高达92.53%和93.22%。对转基因植株诱导的试管薯的淀粉、可溶性糖、蛋白质、蔗糖和葡萄糖含量测定结果表明,与未转基因的对照相比,转基因植株的淀粉含量提高了4.29%~34.27%,蛋白质含量提高了1.47%~7.35%,可溶性糖含量提高了1.44%~17.39%;蔗糖含量提高了11.53%~53.84%,而葡萄糖含量降低了6.06%~21.21%。     

甜菜碱对三元育肥猪血清中TP、BUN、IgG含量和ChE活性的影响

旨在研究饲粮中不同甜菜碱水平对三元育肥猪血清中TP、BUN、IgG含量和ChE活性的影响。选取60头3月龄左右、体重相近(49kg±4.04kg)的杜大长三元杂交育肥猪,随机分为4组,对照组饲喂基础饲粮(无甜菜碱),试验组分别饲喂在基础饲粮中添加1 000、1 500、2 000mg/kg甜菜碱的试验饲粮。饲喂试验前后前腔静脉采集抗凝血液,分离血清,全自动生化分析仪测定血清中TP、IgG、BUN含量和ChE活性,应用SPSS23.0软件进行统计学处理与分析。结果表明,3个水平甜菜碱对三元育肥猪血清中BUN含量和ChE活性无显著影响(P0.05);3个水平甜菜碱可显著提高血清TP含量(P0.05);在1 500mg/kg甜菜碱水平下,饲喂前后TP与IgG含量变化与对照组相比极显著升高(P0.01);饲粮中甜菜碱添加量为1 500mg/kg时饲喂效果最好,可促进三元育肥猪蛋白质合成代谢、提高其免疫力,是育肥猪饲粮甜菜碱最适添加量。     

水分胁迫下苜蓿品种抗旱生理生化指标变化及其相互关系

研究在水分胁迫下4个紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品种抗旱生理生化指标的变化及其相互关系。结果表明:叶片水分饱和亏缺、甜菜碱含量、甜菜碱醛脱氢酶活性和脱落酸含量在水分胁迫下明显增加,品种间差异显著;叶片水分饱和亏缺在中度和重度胁迫下明显增加,其中WL323和皇后苜蓿较高,Vector和敖汉苜蓿较低;WL323和Vector苜蓿甜菜碱含量随着水分胁迫强度的增加而增加,皇后和敖汉苜蓿表现出先增加后降低的趋势,含量较高的是Vector和敖汉苜蓿;Vector苜蓿的甜菜碱醛脱氢酶活性随着胁迫强度的增加而增加,皇后、WL323和敖汉苜蓿呈单峰变化,在中度胁迫下达到最大值;在水分胁迫下ABA含量明显增加,其中变化最大的是敖汉苜蓿,WL323苜蓿变化最小;脱落酸通过甜菜碱醛脱氢酶间接影响苜蓿叶片在水分胁迫下甜菜碱的积累;敖汉苜蓿的抗旱性最强,其次是Vector,WL323和皇后苜蓿抗旱性较弱。     

过量表达紫花苜蓿MsHB7基因对拟南芥耐旱性的影响

同源异型域-亮氨酸拉链蛋白（HD-Zip）第I类亚家族在植物非生物胁迫调控过程中起着重要作用,已在多个物种中进行了克隆鉴定,但关于紫花苜蓿该家族基因的研究还鲜有报道。本研究旨在研究紫花苜蓿HD-Zip第I类亚家族基因MsHB7对拟南芥抗旱性的调控功能。通过克隆得到大小为738 bp、编码245个氨基酸的MsHB7基因的开放阅读框。多重序列比对和系统进化树分析结果显示,MsHB7蛋白属于HD-Zip I亚家族,且与拟南芥中ATHB7和ATHB12亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明,MsHB7基因受干旱诱导。将MsHB7基因转化拟南芥并获得了阳性植株。干旱处理后,转基因拟南芥比野生型拟南芥萎蔫程度更明显,转基因植株相对含水量显著低于野生型拟南芥,并积累了更多的脯氨酸和丙二醛。qRT-PCR检测发现处理之后逆境胁迫指示基因ATCAT1、 ATDREB2A和ATRD29A在转基因拟南芥中的表达量显著升高,而ATLEA3的表达量显著下降。上述结果表明MsHB7基因的过表达可降低转基因拟南芥的耐旱性,为进一步开发利用该基因提供理论依据。     

甜菜碱对育肥猪生长性能和PRKAG3基因相对表达量的影响

为了研究甜菜碱对育肥猪生长性能和PRKAG3基因表达量的影响,试验采用单因子试验设计,选用80 kg左右的健康杜长大三元杂交猪60头,随机分成4组,每组3个重复,每个重复5头猪,在日粮中添加甜菜碱0,500,1 000,1 500 mg/kg,试验期为41 d,试验结束后随机选择(每组随机选择3头)12头猪进行屠宰测定。结果表明:与对照组相比,日粮中添加甜菜碱对育肥猪的日增重、日采食量、料重比均有明显影响,可以不同程度地提高日增重和采食量,降低料重比,其中以添加1 500 mg/kg甜菜碱(4组)的效果最为明显;日粮中添加甜菜碱可以不同程度地提高育肥猪PRKAG3基因的表达量,其中以1 500 mg/kg甜菜碱(4组)的效果最为明显。说明甜菜碱可以提供甲基供体,节约蛋氨酸和胆碱,从而提高育肥猪的生长性能。     

转OvBAN/bar双价基因的紫花苜蓿对虫蚀及除草剂的耐受性分析

以"甘农3号"紫花苜蓿为受体,利用农杆菌介导法导入双价基因OvBAN/bar,通过PCR检测和Southern杂交分析表明,4个转基因株系含有目的基因且均出现杂交条带,其中2个株系为单拷贝,1个株系为双拷贝,1个株系为三拷贝;对获得的4株转基因苜蓿进行qRT-PCR分析表明,具有三拷贝数的1个转基因株系OvBAN基因的表达量最高,其次为双拷贝数的2个转基因株系,并且这些株系的花青素还原酶活性及缩合单宁含量均显著高于野生型苜蓿。以过量表达OvBAN基因的3株转基因苜蓿为试验材料,进行抗蚜性和除草剂耐受性分析。结果表明,与野生型苜蓿相比,转OvBAN/bar基因苜蓿对苜蓿蚜都具有较好的抗性,蚜虫抑制率为78%~93%;用0.5%的市售草铵膦喷施各株系,10d后各转基因株系除个别叶片枯萎死亡,其他叶片及茎秆生长状况良好,而野生型苜蓿全部枯萎死亡,表明bar基因已整合到转基因苜蓿基因组中并稳定表达。综上所述,转OvBAN/bar基因紫花苜蓿表现出良好的抗虫性和除草剂耐受性。     

外源甜菜碱对桑树抗盐生理的影响及其作用机理的研究

为探讨提高桑树抗逆境反应的新途径,对桑树扦插幼苗叶面喷施甘氨酸甜菜碱,调查外源甜菜碱对桑树生长发育及抗盐生理的影响,测定不同处理条件下桑树体内的甜菜碱含量。试验结果表明:在盐胁迫条件下,叶面施用甜菜碱可以提高叶片中叶绿素、可溶性糖及脯氨酸的含量,并保持叶片适当含水率和K+/Na+离子平衡,减轻盐胁迫对桑树枝叶生长的抑制作用。盐胁迫或叶面喷施甜菜碱均可显著诱导桑叶和根部内源甜菜碱的合成与积累,表明桑树属于甜菜碱积累型植物,外源甜菜碱对桑树抗盐性的增强效应可能与甜菜碱积累及相关生理过程有关。     

盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析

根据大豆盐胁迫RNA-Seq数据,筛选并克隆得到1个大豆WRKY类转录因子GmWRKY6基因。序列分析表明,该基因含有1 个1674 bp的开放阅读框,编码557 个AA,编码蛋白属于IIb 类WRKY 家族成员,含有1个WRKY 保守结构域和1个C₂H₂锌指结构基序。基因表达模式分析表明,GmWRKY6基因在大豆根中表达量较高,并且该基因受盐胁迫诱导表达。构建GmWRKY6基因的植物超表达载体,获得7株T₀代阳性转GmWRKY6基因百脉根。进一步对T₁代转基因株系进行抗盐分析发现,在200 mmol·L^-1 NaCl 处理14 d后转基因株系生长状态良好,而野生型对照生长矮小,叶片干枯。此外,对相关生理指标的测定发现,转基因株系叶片中脯氨酸和叶绿素含量显著高于野生型对照,而丙二醛含量和相对质膜透性显著低于野生型对照。此外,盐胁迫下转基因百脉根叶片中钠离子含量显著低于对照,而钾离子含量显著高于对照。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的超表达能够显著增强百脉根的抗盐能力。     

甜菜碱对瘦素缺陷小鼠肌肉组织中脂质沉积的影响初探

为探究甜菜碱对瘦素缺陷（ob/ob）小鼠肌肉组织中脂质沉积的影响和潜在机制，本研究将12只同批次6周龄雄性、健康、体重差异不超过1 g的ob/ob小鼠随机均分为两组，分别作为试验组和对照组。其中对照组小鼠饮用纯净水，试验组小鼠饮用的纯净水中含1%甜菜碱。1个月后脱颈处死，采集肌肉样本，利用油红O染色、甘油三酯含量测定检测ob/ob小鼠肌肉组织中脂质沉积情况；利用气象色谱-质谱联用系统分析肌肉组织中脂肪酸组成及含量；利用qRT-PCR方法检测肌肉组织中基因表达的变化。结果显示：与对照组相比，1）补饲甜菜碱后ob/ob小鼠的体重增加量、肌肉组织中脂质沉积、禁饲血糖水平显著降低（P<0.05）；2）补饲甜菜碱后，ob/ob小鼠肌肉中脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triacylglyceride lipase，ATGL）、激素敏感性甘油三酯脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）以及葡萄糖转运蛋白4（glucose transpoter 4，GLUT4）基因的表达量极显著升高（P<0.01）；3）补饲甜菜碱后，ob/ob小鼠肌肉中饱和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA）和多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）含量显著升高（P<0.05）；4）补饲甜菜碱后，ob/ob小鼠肌肉中脂肪酸合成基因：脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）表达量显著降低（P<0.05），乙酰辅酶A合成酶（acetyl-CoA synthetase，ACS）表达量无显著性变化（P>0.05）；脂肪酸氧化基因：过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARα）、酰基辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase2，ACOX2）、长链酰基辅酶A脱氢酶（long chain acyl-CoA dehydrogenase，ACADL）、脂肪酸转位酶（fatty acid transposase， CD36）表达量极显著升高（P<0.01）。结果表明，ob/ob小鼠补饲甜菜碱后，肌肉组织脂肪酸合成基因表达降低、脂肪酸氧化基因表达升高，同时肌肉组织脂肪酸含量发生改变，最终导致肌肉组织脂质减少。