环介导恒温扩增（LAMP）——检测沙门氏菌

建立一种能够快速准确地检测沙门氏菌的LAMP方法。根据沙门氏菌invA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性试验,通过LAMP与PCR灵敏度的试验与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为63℃,只对沙门氏菌进行扩增;沙门氏菌的检测灵敏度为7～8cfu／mL。LAMP方法检测沙门氏菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测沙门氏菌的新方法。     

动物饲料中沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)快速诊断方法的建立

根据GenBank公布的沙门氏菌高度保守的fimY蛋白基因序列,利用Primer explorer V4软件设计4条针对沙门氏菌fimY基因的特异性引物,通过对Mg²⁺浓度、dNTP浓度、反应温度、反应时间、特异性、敏感性、重复性和稳定系及符合率等方面,优化LAMP各种反应条件,建立针对沙门氏菌LAMP快速诊断方法。结果表明,该方法具有较强的特异性;比PCR检测方法敏感性高100倍,对沙门氏菌的最低检出量为6.2 CFU/mL;对24份样品的3次检测结果与国标法完全一致。证明建立的针对fimY蛋白基因的LAMP检测方法操作简便,特异性强,敏感性高,适用于现场检测。     

环介导恒温扩增技术在动物病原检测中的应用

环介导恒温扩增技术(LAMP)是一种新型核酸扩增技术,是依赖于靶目标上6个区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶Bst的作用,在60 ℃～65 ℃恒温条件下1 h之内即可完成的基因扩增技术.该技术虽然起步较晚,但发展迅速,目前在很多领域的研究和应用已经取得很大进展.论文从技术原理、引物设计、反应机制和特点等方面了介绍了环介导恒温扩增技术,并就该技术在动物细菌性病原微生物、病毒和寄生虫检测中的应用做了介绍.     

环介导恒温扩增技术快速检测非洲猪瘟病毒

以人工合成的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72全长基因为模板,利用在线软件Primer Explorer4设计环介导恒温扩增(LAMP)的内、外引物,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了ASFV的LAMP检测方法,同时进行了敏感性和特异性试验。结果表明,所建立的LAMP检测方法最低检测限可达10拷贝质粒DNA,且具有良好的特异性,LAMP产物的酶切鉴定也验证了反应的特异性。对凝胶电泳后紫外观察、肉眼观察颜色变化、生成沉淀观察以及实时荧光PCR扩增曲线Ct值判定等不同判定方法进行比较表明,以上结果判定方法各有其优缺点,其中荧光PCR的敏感性最高,染色法相对较方便直观,电泳法敏感性稍低。     

鹦鹉热衣原体荧光环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立

鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)是一种人兽共患病原体,能引起自然疫源性衣原体病,目前广泛分布于世界各地。本研究应用环介导等温扩增技术(LAMP),针对鹦鹉热衣原体23S RNA基因序列设计引物,并进行筛选以及敏感性和特异性试验,建立了鹦鹉热衣原体恒温荧光扩增方法。该方法在63℃恒温条件下1 h内即可显示结果,操作简单、快速,特异性强,灵敏度可达100拷贝/μL,且与流产衣原体、动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;用国产仪器可直接通过检测荧光信号判读结果,既增强了准确性,也避免了开盖污染产生假阳性;应用建立的LAMP方法对实验室保存的临床DNA样品进行检测,发现检测结果与QPCR相同。该方法的建立弥补了传统检测技术的不足,为实现鹦鹉热衣原体的现场快速诊断提供了技术支持。     

非洲猪瘟病毒环介导恒温扩增快速检测技术的建立及应用

本研究基于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）vp72基因设计引物,建立了能够快速检测非洲猪瘟病毒的环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。将LAMP与OIE参考的PCR检测方法进行比较,并且应用LAMP对非洲猪瘟参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组以及国内收集的50份猪的基因组、30份蜱的基因组进行检测。结果显示,本研究设计的引物具有良好的特异性和敏感性,所建立的LAMP能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组,而野外收集的猪和蜱的基因组检测均为阴性。因此,本研究所建立的方法能够用于非洲猪瘟的快速诊断以及防控。     

环介导等温扩增法(LAMP)在水生动物病害检测中的应用

近年来我国的水产养殖发展迅速,养殖面积和产量都位居世界第一。但是疾病频发一直是困扰水产养殖的一个问题,而病原的快速检测是水产动物疾病防控的前提和关键。随着水产病害基础研究的不断深入,病原的检测技术也得到快速发展。本文介绍了一种新型的核酸扩增技术——环介导等温扩增(l oop-medi at ed i sot hermalampl i f i cat i on,LAMP),综述了近年来LAMP方法在水生动物病害检测领域的具体应用实例和研究进展,并对该方法的应用前景做了展望。     

环介导等温扩增(LAMP)检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒的VP2基因序列,设计并合成了6对特异扩增禽脑脊髓炎病毒VP2基因片段的引物,通过条件优化,成功建立了针对禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测法,并测定其特异性和敏感性,对采集的禽临床样品的核酸分别进行了检测.结果表明,该法只检出禽脑脊髓炎病毒.敏感性扩增结果表明,Lamp检测禽脑脊髓炎病毒为100fg的RNA模板.该LAMP方法有简便、快速和特异性高的优点,可用于临床上对禽脑脊髓炎病毒的快速检测.     

环介导等温扩增(LAMP)技术的应用现状

LAMP技术具有简便、快速、高效、特异性强等优点,尤其适用于人类和动物疾病的检测,本文重点论述了目前LAMP方法在病原微生物检测、临床诊断、胚胎性别鉴定以及转基因食品等领域的应用及研究情况。表明该方法已具有成功应用的现实性,为快速基因检测提供了一种新的技术途径,可望作为常规检测工具。     

志贺氏菌属环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立快速检测志贺氏菌属的方法,本研究针对其ipaH基因,建立了志贺氏菌属环介导恒温护增(LAMP)快速检测方法。利用该方法对50株细菌进行检测,结果显示7株志贺氏菌均为阳性,其它菌均为阴性,表明该方法具有高度特异性。灵敏度试验显示,对志贺氏菌纯培养菌的检测灵敏度为28cfu/mL,对污染食品中志贺氏菌的检测灵敏度为35cfu/mL。利用该方法对195份涉及肉类、奶类、豆制品及人工污染样品进行检测,共检出29份阳性样品,与细菌分离鉴定检测结果一致。该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,具有良好的应用前景。     

印第安纳沙门菌环介导等温扩增检测方法的建立

旨在解决印第安纳沙门菌传统检测方法的缺陷,建立快速、特异、灵敏的分子检测方法.通过比较基因组学方法获取印第安纳沙门菌特异性检测靶标,进一步设计用于环介导等温扩增的引物组.通过对反应条件优化,建立针对印第安纳沙门菌的特异性分子检测方法.结果显示,该检测方法特异性强、耗时短,检测下限为59拷贝?反应-1.应用该方法对临床分...     

环介导等温扩增技术检测酸乳中蜡样芽孢杆菌

目的：建立快速准确检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的方法.方法：根据蜡样芽孢杆菌hblA基因设计特异性引物,通过环介导等温扩增技术（LAMP）直接检测酸乳中蜡样芽孢杆菌,扩增产物电泳检测.结果：LAMP法检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的特异性强,方法检出限6.4CFU/mL,人工污染检出限21CFU/mL.结论：LAMP法用于检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的灵敏度高、耗时短,为酸乳中蜡样芽孢杆菌的快速检测提供了新的方法.     

肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域,设计2对引物（1对内引物、1对外引物）,进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料（dNTPs）、内外引物比例、Mg²⁺浓度、反应时间和温度进行优化和选择,并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明,通过优化试验,筛选到最优反应体系和反应条件;应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验,特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875 pg/μL,比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测,检测限为30 CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法,该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增,灵敏性更高,反应时间更短,检测成本更低。     

羊源性成分LAMP检测方法的建立

根据羊cyt B基因设计3对特异性引物,运用GenieⅡ等温扩增荧光检测系统,以LAMP荧光检测方法为基础,建立了检测羊源性成分的LAMP方法,并对该方法进行了反应体系和条件的优化。试验结果表明:该方法操作简单、特异性好;灵敏度比普通PCR方法高100倍,比q PCR方法低10倍,达到5.928×10-3μg/μL;反应时间短,最快10 min即可完成反应。     

环介导等温扩增技术快速检测犬细小病毒方法的建立

旨在建立一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)检测犬细小病毒感染的新方法。根据Gen-Bank中犬细小病毒(CPV)VP2基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、敏感性、可视化效果和应用效果进行研究。结果显示,在65℃等温条件下、1h内可完成LAMP扩增过程;病毒的最低检出限量为10-2个TCID50/mL;特异性和可视效果良好;对36份临床标本进行检测,阳性检出率为80.5%(29/36),检出率高于普通PCR 72.2%(26/36)。建立的LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬细小病毒感染提供了一种快速简便的新方法。     

布鲁氏菌环介导等温扩增（LAMP）可视化检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性,并对60份牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)阳性血清样本,经LAMP和B4/B5-PCR方法进行平行检测。结果显示,本方法最低检出限约为17fg布鲁氏菌基因组DNA。本方法特异性良好,布鲁氏菌反应管均出现特异性LAMP扩增反应,而猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。针对60份RBT阳性血清的平行检测结果显示,LAMP和B4/B5-PCR这两种方法间的结果符合率为85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品,经本方法检测全部为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的17份样品,经本方法检测,9份为阳性,8份为阴性。LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。实验表明,本文所建立的基于颜色判定的布鲁氏菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。     

基于钙黄绿素显色的可视化LAMP检测猪流行性腹泻病毒的研究

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的NP基因设计1套环介导等温扩增(LAMP)引物,在反应体系中添加钙黄绿素/氯化锰指示剂代替传统的反应后添加SYBR Green Ⅰ染料,建立了基于钙黄绿素的可视化LAMP检测PEDV的方法。该方法能在65 ℃ 1 h内特异性扩增PEDV,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)及大肠杆菌等均无交叉反应,检测下限为3.73 pg/μL,其结果可用肉眼判断,快捷方便。用该方法对龙岩学院动物医学研究所接诊的93份腹泻病例进行检测,结果表明,LAMP方法检测PEDV的阳性率为43.01%(40/93),高于普通PCR的检出率(38.7%,36/93)。本试验建立的可视化LAMP检测方法能用于PED诊断。     

应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。     

PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌

建立了扩增invA基因检测沙门氏菌的PCR方法。对收集的50个血清型123株沙门氏菌及7种27株非沙门氏菌进行PCR,2％琼脂糖电泳检查,结果所有沙门氏菌都扩增出了300bp的特异性产物,非沙门氏菌都未扩增出此目的条带。产物的特异性由slot blot杂交进一步证实。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中10pg染色体DNA及10~2cfu的纽波特沙门氏菌50029。为下步克隆而设计的两个酶切点（Bam HI,Eco RI）对引物的特异性没有影响。本研究为沙门氏菌的检测提供了简洁、敏感、特异的新方法,同时为克隆invA基因做属特异性探针打下了基础。