大豆花叶病毒致病基因的克隆与序列分析

通过生物学纯化与血清学鉴定(ELISA)得到5个大豆花叶病毒(SMV)分离物,利用RT-PCR法扩增其CP、HC-Pro、P1和P3基因片段并进行测序。结果表明:5个分离物P1基因全长均为927个核苷酸,编码产生309个氨基酸。同源性分析表明,5个分离物核苷酸序列同源性为88.0%~99.9%,由此推导的氨基酸序列同源性为86.1%~100.0%。此外,5个分离物4个SMV基因CP、HC-Pro、P1和P3长度均为4 137个核苷酸,编码1 378个氨基酸。分析结果显示,5个分离物之间的核苷酸及氨基酸的同源性分别为92.6%~99.3%和95.1%~99.2%。根据系统进化树的分析,结合5个分离物在10个大豆鉴别寄主上的致病性反应,发现SMV的4个基因CP、HC-Pro、P1和P3与SMV的致病力及病样的来源地之间具有一定的关系。同时,这4个SMV基因能够将传统的SMV株系分离物与重组性分离物进行区分。     

茶树品种“小雪芽”冷诱导锌指蛋白基因cDNA研究

分析了低温诱导型新梢白化茶树品种“小雪芽”叶片低温诱导锌指蛋白基因cDNA序列。该序列长度为698bp,与大豆锌指蛋白mRNA同源性为83％,与蓖麻锌指蛋白mRNA同源性为82％;具有可编码230个氨基酸的开放阅读框。与“福鼎大白茶”冷诱导锌指蛋白eDNA序列相比,该eDNA序列在50—51位上核苷酸AT缺失,第143位的A被置换为G,第654位T缺失。其翻译的蛋白质氨基酸序列与“福鼎大白茶”同源性达到99％,但有3个位点的氨基酸变异。该基因表达丰度明显低于“福鼎大白茶”。研究认为,基因结构差异,引起表达强度和蛋白质氨基酸序列的差异,可能是引起“小雪芽”品种对低温敏感的重要因素。     

大豆花叶病毒5个分离物的鉴定及外壳蛋白序列分析

通过生物学纯化与血清学鉴定(ELISA)得到5个大豆花叶病毒(SMV)分离物,利用RT-PCR法扩增其外壳蛋白(CP)基因片段并进行测序,结果表明:5个分离物CP基因全长均为795个核苷酸,编码产生265个氨基酸.同源性分析表明,5个分离物核苷酸序列同源性为91.1%～97.1%,由此推导的氨基酸序列同源性为98.1%～99.2%.结合5个分离物在8个大豆品种上的致病性反应得出,5个分离物在8个鉴别寄主上的致病性反应和序列差异的比较表明,分离物在8个鉴别寄主上致病性反应相差越大,其CP基因氨基酸序列差异就越大,由此证实SMV的CP基因与致病性反应之间有一定的联系.     

甘蔗GA20氧化酶基因片段克隆及序列分析

以甘蔗茎尖为材料,根据其它植物的GA20氧化酶基因(GA20-oxidase)氨基酸保守区,设计一对简并引物.通过RT-PCR扩增得出1条约740 bp大小的DNA片段.将其克隆至pMD18-T载体上,而后对重组克隆进行测序,结果表明所获得的甘蔗GA20氧化酶基因片段由740碱基组成,编码246个氨基酸.该基因片段具有其它植物GA20氧化酶基因中存在的保守区:同时,与多种单子叶植物的GA20氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性在80%和75%以上.聚类分析显示,甘蔗和玉米最先聚类,推测在进化上具有较近的亲缘关系,其次与高梁、结缕草聚类,然后再与水稻聚类,其中进化关系最远的是簇毛麦和小麦.     

水稻杂种超亲表达26S蛋白酶体亚基基因OsHL1的克隆

运用DDRT PCR分离获得水稻杂种一代超亲表达的cDNA片段。以此序列在日本晴cDNA全长数据库进行同源搜索,检索到一个功能未知的全长cDNA,有1690 bp,命名为OsHL1,进一步分析发现它位于3号染色体上R2393和MRG4548之间。序列分析表明,该基因与日本晴编码26S proteasome regulatory particle non ATPase subunit 5基因片段的序列同源性为97％。其中包含一个完整的开放阅读框(ORF),编码443个氨基酸,氨基酸序列同源性分析发现高度保守区。RT PCR显示OsHL1基因的表达受到ABA和MeJA处理下调。推测杂种的表现可能与26S蛋白酶体亚基参与的信号调控相关。     

橡胶树炭疽病菌Cap20基因的克隆和序列分析

根据鳄梨胶孢炭疽菌Cap20基因序列设计引物,利用同源基因克隆法获得橡胶树胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌Cap20基因,同时进行核苷酸序列、氨基酸序列及聚类分析。结果表明:2种橡胶树炭疽菌的Cap20基因均含2个外显子和1个内含子,编码183个氨基酸;橡胶树胶孢炭疽菌与鳄梨胶孢炭疽菌同源性最高,其核苷酸序列同源性达90.3%,氨基酸序列同源性达98.9%;来自橡胶树的2种炭疽菌Cap20基因序列存在较大差异,其核苷酸水平同源性仅为73.8%,氨基酸水平同源性为79.8%;炭疽菌CAP20和绿僵菌MPL1蛋白结构具有42%的同源性,所含蛋白结构域相似,推测炭疽菌Cap20基因可能与绿僵菌Mpl1基因功能具有相似性。     

稻瘟病菌3—磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及序列分析

以ＰＣＲ为基础结合ｃＤＮＡ库构建,分两段克隆稻瘟病菌的３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ｇｐｄ）分别测序,合并,获得该基因编码区全部１０１１ｂｐ的核苷酸序列,可以编码３３６个氨基酸和１个终止密码子ＴＡＡ。该序列与其它１２种丝状真菌的已知ｇｐｄ基因序列有着高度的同源性,它们的核苷酸序列同源性为６１．４％～８６．６％,氨基酸序列同源性为６４．６％～８６．３％,尤其在酶活性功能区,不同丝状真菌间有着近１００Ｔ     

龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

黑皮冬瓜NBS类抗病基因同源序列克隆与分析

以黑皮冬瓜"B98K"种质为试材,根据已克隆的植物NBS类抗病基因保守结构域设计简并引物,PCR扩增冬瓜基因组DNA,获得对应区段的DNA片段,回收克隆与测序后,得到19条抗病同源序列(命名为DNB1至DNB19)。利用DNAStar软件进行序列分析及同源性比对发现,这些抗病同源序列长度在249~252 nt之间,其核苷酸序列同源性在48.4%~98.8%之间,氨基酸序列同源性为23.2%~100.0%,推导氨基酸序列具有P-loop(GGVGKTT)、Kinase-2a(VLDDVW)典型的NBS保守结构域。同源进化分析将其全部归为non TIR-NBS-LRR类,与推导氨基酸序列多重比较结果一致;该序列与其他作物已克隆抗病基因的氨基酸序列同源性在24.7%~99.0%之间。该组序列已登录Genbank,登录号为KF776401~KF776419。     

南农87C-38大豆优质11S球蛋白Gy7基因克隆及序列分析

大豆种子不仅富含蛋白质,而且赖氨酸含量较高,利用大豆高赖氨酸基因能够弥补谷类作物种子赖氨酸含量的不足.运用现代分子生物学技术,从高蛋白大豆南农87C-38中克隆11S球蛋白Gy7全基因及cDNA序列.经生物公司测序后,利用vector NTI软件将所克隆的Gy7全基因及cDNA序列与Genbank(AF319776和AF319777)报道的序列进行比对分析,同源性分别为99%和99.6%.序列比对结果显示,Gy7基因cDNA与Genbank报道的序列之间所有的核苷酸差异都位于第3外显子.由此推测,第1、第2和第4外显子编码的氨基酸对于G7多肽形成特定高级结构可能具有非常重要的作用,它们在进化过程中受到的选择压力可能比第3外显子更强.根据遗传密码表推测,克隆的Gy7与Genbank报道的cDNA序列所编码的多肽,两者存在2个氨基酸组成的差异.大豆球蛋白Gy7优质基因的获得为今后利用转基因技术改良水稻、小麦等谷类作物的营养品质奠定了基础.     

甘蔗近缘属斑茅组织培养高频再生体系的建立

以甘蔗近缘属植物斑茅的幼嫩叶片为材料,研究MS、SH、B5三种基本培养基和不同激素(2,4-D、NAA、6-BA)配比对斑茅愈伤组织诱导及继代培养的影响,并筛选出斑茅细胞高频再生体系的最优培养基配方。研究结果表明,斑茅幼嫩叶片愈伤组织诱导培养基以MS+2,4-D 3.0 mg/L+6-BA 0.4 mg/L为最适,愈伤组织继代培养基以MS+2,4-D 3.0 mg/L为最适。在此条件下诱导的愈伤组织质地疏松,具有较强的分化能力。目的是建立斑茅组织培养的高频再生体系,为斑茅材料的细胞悬浮培养、染色体加倍和细胞融合等研究提供一定参考。     

斑茅SAMDC基因的克隆及其原核表达分析

以斑茅(Erianthus arundinaceus)samdc基因的cDNA为基础,采用基因重组技术,将该基因按正确的阅读框架定向克隆于原核表达载体pET-29a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.结果表明:重组斑茅samdc基因在大肠杆菌中获得高效表达,其分子量约为43.281kDa.斑茅samdc基因原核表达载体的成功构建和重组斑茅SAMDC蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

油菜叶片衰老相关基因的分离：ATP硫化酶cDNA的克隆和序列分析

通过筛选缩减ｃＤＮＡ文库中在油菜叶片衰老阶段表达而在绿叶中不表达的ｃＤＮＡ克隆，分离了与油菜叶片衰老有关的基因ＬＳＣ６６。ＤＮＡ序列测定和分析结果表明，ＬＳＣ６６的全长可读框架由１３８０个碱基组成，编码４６０个氨基酸，它的核昔酸序列与拟南芥菜ＡＴＰ硫化酶基因有８６．６７％的同源性，其推导的氨基酸序列与拟南芥菜ＡＴＰ硫化酶的氨基酸序列有９１．７４％的同源性。对ＬＳＣ６６基因产物在植物叶片衰老过程中的作用进行了讨论。     

大豆属(Glycine)亚属间和种间种子氨基酸组成的比较分析

比较了大豆属14个种的种子蛋白氨基酸的组成。结果表明:①不同亚属的各种均以谷氨酸含量最高,天门冬氨酸次之,其它氨基酸含量的位次也基本一致。②大豆属中亚属间种子蛋白的氨基酸含量存在明显的差异,Soja亚属各种氨基酸含量最高,Glycine亚属均低,而Wighlii最低。③亚属内种间、以及种内地理来源不同、或染色体基数不同,氨基酸含量也有差异。④Glycine亚属中latrobeana种的种子蛋白的氨基酸含量明显高于其它种。讨论了Glycine属、亚属间氨基酸含量与进化的可能联系,以及Wighlii的归属问题。     

水稻谷蛋白基因GluB-6的cDNA克隆及表达

根据已克隆谷蛋白基因的保守氨基酸序列搜索基因组数据库,获得与之高度同源的水稻基因组序列,通过生物软件进行基因预测和验证,用RT PCR法克隆得到1个新的谷蛋白基因的cDNA克隆。核酸序列分析和体外表达结果表明,该基因cDNA序列全长为1517 bp,含有1个编码495个氨基酸残基的开放阅读框（ORF）,推导的氨基酸序列与谷蛋白基因家族的相似性介于53.6%~82.8%,并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高,因此命名为GluB 6（GenBank注册号AY429651）。Northern杂交显示,GluB 6基因具有高度的胚乳表达特性。     

花生中两个硬脂酰-ACP去饱和酶基因的克隆与序列分析

脂肪酸去饱和酶是不饱和脂肪酸合成途径的关键酶,催化脂肪酸链特定位置上脱氢形成双键.本研究通过构建花生种子全长cDNA文库,结合大规模EST测序和RACE克隆等方法,从花生中克隆得到了两个FAB2基因,分别命名为AhFAB2-2和AhFAB2-3.其中AhFAB2-2全长为1387bp,ORF为1158bp,理论分子量为43.7 kD,理论等电点为5.69;AhFAB2-3全长为1452bp,ORF为1188bp,理论分子量为44.9 kD,理论等电点为6.37.它们推导的氨基酸序列与拟南芥的相似性依次为60.8％和57.2％;与大豆的相似性分别是62.3％和59.3％.这两个基因在GenBank上的登录号分别为KF358459和KF358460.     

木豆贮藏蛋白基因的克隆及其序列分析

根据几种豆科植物贮藏蛋白基因序列同源性设计简并引物,通过反转录扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测和测序,并利用NCBI数据库及Blast工具进行分析,从木豆中克隆得到1个贮藏蛋白基因的cDNA片断,长度为833 bp.采用RACE、RT-PCR技术扩增得到该基因的全长cDNA,含1 595 bp,推测编码区为1551 bp(16-1566bp),编码516个氨基酸,分子量为57.718 ku,等电点为4.68.该基因推导的氨基酸与大豆(1303273A)、野生大豆(CAA55977.1)、羽扇豆(AEB33710.1)、花生(AAU21493.1)、菜豆(ADR30064.1)、野豌豆(CAA83674.1)为、截形苜蓿(XP_003590690.1)的贮藏蛋白同源性分别达到83％、79％、77％、73％、67％、65％、65％.     

Molecular Cloning and Characterization of Citrate Synthase Gene in Rice （ Oryza sativa）

The full-length OsCS encoding citrate synthase was isolated from rice （Oryza sativa L. subsp, japonica）, OsCS is 1477-bp long and encodes a 474 amino acid polypeptide, Its putative protein sequence is highly identical to Daucus carota, Nicotiana tabacum Beta vulgaris subsp., Arabidopsis thaliana, and Citrus junos （〉70%）. The deduced amino-terminal sequence of OsCS showes characteristics of mitochondrial targeting signal. Southern blot analysis using ORF of the OsCS as the probe indicated that this gene exists in multiple copies in rice genome. The band with predicated size of 82 kD was detected by Western blot after being induced by 0,4 mmol/L IPTG.