水貂白细胞介素-4基因的克隆、序列分析与原核表达

为了获得高纯度的白细胞介素-4（IL-4）蛋白,对分离得到的水貂外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导后,提取淋巴细胞总RNA,根据GenBank中登录的雪貂IL-4基因序列,设计并合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得了水貂IL-4基因序列全长399 bp,编码132个氨基酸,与雪貂氨基酸序列同源性高达99.2%,与熊猫、犬同源性均为90.0%。将编码成熟蛋白基因构建到原核表达载体pProEX-HTb,IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting结果显示,IL-4表达产物为15 ku的包涵体蛋白。通过His-Trap HP亲和层析预装柱变性、复性洗脱可获得高纯度的重组IL-4蛋白。本试验为水貂IL-4基因的进一步研究奠定了基础。     

1株貂源绿脓杆菌噬菌体的分离与鉴定

从水貂粪便中分离并纯化1株绿脓杆菌噬菌体,为测定其各项生物学特性。从水貂场采集粪便,利用双层平板法分离噬菌体,对分离到的噬菌体进行电镜形态观察、裂解谱、效价、最佳感染复数、温度和pH值敏感性以及一步生长曲线的测定。结果显示,从水貂样品中分离纯化得到一株绿脓杆菌噬菌体,命名为phage30。电镜形态特征表明,该噬菌体头部为二十面体的立体对称结构,直径约为60 nm,尾部长180 nm,属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科;噬菌体裂解率为29.63%(8/27);在宿主菌中增殖的效价为4.3×10~(10 ) PFU/mL。生物学特性测定结果表明,噬菌体在pH值5～11、温度40℃以下裂解活性基本保持不变,最佳感染复数为0.01;一步生长曲线测定结果显示,噬菌体潜伏期约为60 min,暴发期约120 min,裂解量约为156。表明从水貂粪便分离到这1株绿脓杆菌噬菌体,属长尾噬菌体科,具有宿主谱宽、裂解性能高、pH值和热稳定性好的特征,具有潜在的开发价值。     

水貂绿脓杆菌(PASD03)鞭毛蛋白免疫原性的研究

为了研究水貂绿脓杆菌(PASD03)鞭毛蛋白的免疫原性,采用酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验、试管凝集试验和免疫印迹试验,对鞭毛蛋白免疫的兔抗血清进行了检测。结果表明:酶联免疫吸附试验呈阳性反应,血清稀释倍数在1∶80~1∶100之间最好;免疫扩散试验抗体效价达1∶64,试管凝集试验抗体效价在1∶1 600~1∶3 200之间;免疫印迹试验在53.0 ku左右出现1条特异性条带。说明检测的鞭毛蛋白具有较高的抗原性,为有效控制水貂绿脓杆菌病提供了新型候选疫苗源。     

水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及病毒样颗粒制备

试验旨在制备水貂肠炎病毒（Mink enteritis parvovirus,MEV）可溶性VP2蛋白及其病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）。优化并合成MEV VP2基因,克隆至原核表达载体pET-30a（+）,将重组质粒pET-30a-VP2与分子伴侣pTf16共同转化到宿主菌ER2566中,以不同培养温度、L-阿拉伯糖浓度和IPTG浓度进行诱导表达,收集样品进行SDS-PAGE和Western blotting分析。通过硫酸铵沉淀结合蔗糖密度梯度离心法对表达产物进行纯化,由SDS-PAGE进行鉴定,透析去除蔗糖,通过动态光散射技术（DLS）和透射电子显微镜（TEM）观察不同组装条件下VLPs的粒径和形态。用制备的MEV VLPs疫苗免疫水貂评价其免疫原性。结果显示,以2 g/L L-阿拉伯糖、0.2 mmol/L IPTG、25 ℃培养16 h为诱导条件时,VP2蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,分子质量约为65 ku。经Western blotting鉴定VP2蛋白具有良好的抗原特异性。将此表达产物利用硫酸铵沉淀结合蔗糖密度梯度离心法纯化后,纯度可达90%以上。在pH 8.0,150 mmol/L NaCl的透析液中,VP2经自组装可形成与天然MEV形状和粒径相似且具有血凝特性（1：2¹⁴）的VLPs。VLPs疫苗免疫水貂21 d后,测得水貂血清中的血凝抑制（HI）抗体水平均相对最高,可达1：2¹¹,说明该VLP疫苗有较好的免疫原性,能有效预防MEV的感染。本试验结果表明,将pET-30a-VP2与pTf16在原核表达系统中共表达,可获得具有高免疫原性的VLPs,为后期MEV VLPs疫苗的研发奠定基础。     

水貂绿脓杆菌的分离与鉴定

2011~2013年间,从山东省、河北省和江苏省等地的多个貂场疑似水貂出血性肺炎病貂的肺脏、肝脏和脾脏中分离到425株疑似绿脓杆菌。用绿脓杆菌的OprF和PEA基因的PCR引物对分离菌株的目的基因扩增,经核苷酸测序确定其均为绿脓杆菌序列。通过日本生研株式会社血清学分型系统进行分型：G型376株,占88.5%;B型34株,占8%;C型12株,占2.8%;E型3株,占0.7%。取其中6株细菌（G血清型3株,其他血清型各1株）进行详细生化试验,结果显示该6株菌均符合绿脓杆菌的生化特性,并且从这6株中选4株细菌（每血清型各1株）腹腔接种小白鼠和气管内接种水貂,结果表明4株菌对其均有致病性。     

双峰驼乳乳铁蛋白的分离纯化研究

试验以阿拉善双峰驼初乳为研究对象,经离心脱脂、酸沉淀去除酪蛋白并用硫酸铵经2次盐析获得乳铁蛋白粗提物,再通过Sephadex G-100凝胶层析进行纯化。利用考马斯亮蓝和SDS-PAGE电泳定性定量检测。结果表明,乳铁蛋白分子量为81．42kD,每毫升驼乳中能提取乳铁蛋白约0．86mg,纯度可达90％以上。     

鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的原核表达及纯化

本试验旨在表达并纯化鞭毛蛋白,为研究并获得高效蛋白佐剂奠定基础。用PCR扩增鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因fljB、fljB’和fliC,将扩增产物克隆至pMD19-T Simple Vector上,构建了克隆质粒pMD19-fljB、pMD19-fljB’和pMD19-fliC。克隆质粒经双酶切后将片段克隆至pET-30a中,构建原核表达质粒pET30a-fljB、pET30a-fljB’fliC和pET30a-fliC。经PCR、酶切及测序鉴定后将阳性表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达后的菌体经超声处理取上清,用Ni柱进行纯化。Western blotting证实了表达的蛋白能与豚鼠抗鞭毛蛋白血清发生特异性反应。通过优化表达条件,鞭毛蛋白fljB、fliC和fljB’fliC均以可溶性表达,纯化得到的鞭毛蛋白为后续评价其佐剂效应奠定基础。     

一例水貂出血性肺炎的诊治

水貂出血性肺炎是由绿脓杆菌引起水貂以肺出血、肺水肿、呼吸困难、部分水貂突然死亡,并从口鼻流出血样泡沫等为特征的急性败血性传染病。2013年8月份,我市苘山镇某水貂养殖户所饲养的2200只水貂发病,经综合诊治,确定为由绿脓杆菌引起的出血性肺炎。     

2种不同方法纯化乳酸杆菌重组S-层融合蛋白的比较试验

将重组菌E.coliBL21（含重组质粒pGEX-SLP）经IPTG诱导获得重组融合蛋白GST-SLP,分别用非特异性的氯化锂沉淀方法和特异性的Pierce（R）GST Spin Purification Kit纯化方法,将该融合蛋白进行纯化,纯化结果采用SDS-PAGE方法进行鉴定.结果显示,2种方法均能够获得大小约为71 ku的目的融合蛋白,但氯化锂沉淀方法纯化效果不及Pierce（R）GST Spin Purification Kit方法.该研究结果为进一步研究乳酸杆菌S-层蛋白生物学特性提供了参考.     

鸡β2-微球蛋白的基因克隆与原核表达

本研究通过RT-PCR从正常鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增chβ2m 基因全长片段,然后将其克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG对其进行诱导表达,利用HiTrap亲和柱对表达产物进行纯化。结果显示,采用RT-PCR扩增出chβ2m基因全长约360 bp,编码120个氨基酸,与基因库公布的相一致,同源性为100%;经0.8 mM IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析发现chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于细菌裂解上清;利用His标签纯化该蛋白, SDS-PAGE分析仅见约34 kDa大小的chβ2m融合蛋白条带;Western-blot分析表明,纯化后的chβ2m融合蛋白与特异单克隆抗体反应呈现特异性的条带。以上结果证实,本研究成功表达并获得了纯化的可溶性chβ2m融合蛋白,为进一步对chβ2m结构及其功能研究奠定基础。     

Characterization of flagellin from Clostridium chauvoei.

Differential centrifugation and cesium chloride-equilibrium centrifugation were used to purify the flagella from the strain Okinawa of the formalin-fixed Clostridium chauvoei. SDS-PAGE profile of purified flagella showed that a major protein band with a molecular mass of 46 kDa, corresponding to the flagellin monomer, and at least two minor protein bands with molecular masses of approximately 73 and 100 kDa were found. The amino acid composition of C. chauvoei flagellin was similar to the flagellin of Salmonella typhimurium and Bacillus subtilis. In addition, C. chauvoei flagellin monomer shared limited sequence homology with the N-terminal amino acid sequence reported for other bacterial flagellins. N-terminal sequences of two minor bands corresponded to the flagellin monomer, indicating that higher molecular mass bands were polymeric forms of the flagellin monomer.     

Separation and Purification of Cu/Zn-SOD from Newborn Bovine Blood and Prepatation of HEP and CHI Using Layer-by-layer Self-assembly Technique

In order to improve the stability of super oxide dismutase (SOD) with some modification,we used thermal denaturation extraction method to extract Cu/Zn-SOD from newborn bovine blood,and used layer-by-layer self-assembly technique,heparin and chitosan as material to modificate the SOD which separated and purified from newborn bovine blood.The results showed that compared with the natural SOD,the modified SOD increased 3.3 times in the thermal stability;In acid and alkaline,under the condition of pH 3.0 and pH 11.0,the acid-base resistance property of the modified SOD raised 2.0 times;On the antitrypsin hydrolysis ability,the relative enzyme activity of modified SOD had increased 2.7 times than natural SOD.The modified SOD with shell outside made of heparin and chitosan by physical modification could get better effect,and had the strong mechanical strength,better biocompatible,outer surface of chitosan was helpful to cross the cell membrane transport,and it could be applied to the development of oral dosage forms of SOD.     

新生牛血中Cu/Zn-SOD的提纯及肝素、壳聚糖的逐层自组装包裹

试验旨在通过对超氧化物歧化酶（super oxide dismutase, SOD）改性,提高其稳定性。本试验采用了热变性提取方法从新生牛血中提取Cu/Zn-SOD,采用逐层自组装技术,以肝素与壳聚糖为材料,对从新生牛血中分离提纯的SOD进行物理包裹试验,并对包裹后Cu/Zn-SOD的稳定性进行研究。结果显示,在耐热稳定性上,包裹的SOD相对酶活性比天然SOD提高了3.3倍;在耐酸碱性方面,在pH分别为3.0、11.0的条件下,包裹的SOD相对酶活性较天然SOD提高了2.0倍;在抗胰蛋白酶水解的能力上,包裹的SOD相对酶活性较天然SOD提高了2.7倍。采用肝素、壳聚糖制成的外壳对SOD进行物理修饰可得到较好的效果,且其具有较强的机械强度、生物相容性较好,外表面的壳聚糖有助于帮助跨细胞膜转运,可应用于口服剂型SOD的开发。     

Isolation of Theileria sergenti piroplasms from infected erythrocytes and development of an enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of T sergenti infections

A method of obtaining a pure suspension of Theileria sergenti piroplasms from infected bovine erythrocytes was developed and the resulting parasites used as antigen in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Piroplasms were freed from infected erythrocytes using the nitrogen cavitation technique and then separated from unbroken erythrocytes by centrifugation at 670 gmax. The parasites in the supernatant were then sedimented by centrifugation at 2700 gmax and the purified fraction examined by electron microscopy. This examination showed that the isolated piroplasms were morphologically intact and that there were few contaminants. SDS-PAGE and spectrophotometric analysis showed that this fraction contained little erythrocyte component. The piroplasms thus obtained were sonicated and treated with Triton X-100 then used for ELISA antigen. The ELISA values had a high correlation with titres obtained using the indirect fluorescent antibody test on sera from cattle infected with T sergenti.     

兔抗鹅IgG酶标抗体的制备及初步应用

为了研究兔抗鹅IgG酶标抗体的制备,试验采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提,透析除盐,DEAEA-50纤维素层析相结合的方法提取鹅卵黄IgG,经核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG浓度;制备兔抗鹅IgG酶标抗体;利用酶标抗体检测小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因疫苗的免疫效果。结果表明,粗提的IgG浓度为10 mg/mL,抗体纯度可达到94.5%;免疫扩散得出兔抗鹅 IgG抗血清效价约 1∶32,抗体酶标后效价为1∶3000;酶标抗体可以作为检测疫苗效果一种很好的工具。     

鸡鲍氏3型志贺菌脂多糖及O抗原多糖的提纯与鉴定

为获得高纯度的鸡鲍氏3型志贺菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）及其亚单位O抗原多糖(O-polysaccharide,O-PS),采用改良热酚水法提取鸡鲍氏3型志贺菌的LPS,并联合使用葡聚糖凝胶层析得到高纯度的LPS;采用酸水解法联合葡聚糖凝胶层析获得高纯度的O-PS。生化方法检测结果显示所提纯LPS和O-PS纯度高,兔回肠襻试验结果显示所提纯的LPS活性好。本试验结果表明提取的LPS和O-PS可进行特异性研究及制备有效的候选疫苗。     

响应面法优化秃疮花中生物碱提取工艺及抑菌活性研究

以秃疮花为研究对象,在单因素水平测定的基础上,通过响应面法优化其提取工艺,并使用响应面法提取浓缩液进行抑菌活性测定,以大肠埃希氏杆菌为研究对象,进行透射电镜观察。结果显示,秃疮花生物碱最佳提取工艺条件为:液料比15 mL/g、超声时间35 min、回流时间2.5 h、乙醇浓度65%,在此工艺下秃疮花生物碱含量为9.33%;其响应面法提取浓缩液对大肠埃希氏杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌的最小抑菌浓度分别为0.20,0.15和0.35 mg/mL,最低杀菌浓度分别为0.15,0.10和0.30 mg/mL;在透射电镜下观察到对大肠埃希氏杆菌抑制效果显著。表明响应面法对秃疮花生物碱提取工艺的优化比较合理。     

丙型副伤寒沙门氏菌脂多糖提取纯化及活性分析

为了提取、纯化天鹅源丙型副伤寒沙门氏菌脂多糖（LPS）并检测其活性,试验通过热酚水法提取丙型副伤寒沙门氏菌LPS,采用DNaseⅠ、RNase A和蛋白酶K及醇沉法纯化LPS,测定LPS提取物中多糖、蛋白及核酸的含量,鲎试剂检测凝集活性,显色基质法测定其活性。结果显示,纯化的丙型副伤寒沙门氏菌LPS平均产率为1.48%,多糖含量为3.84%,蛋白含量为1.49%,核酸含量为 5.45%,且核酸片段低于100 bp,SDS-PAGE电泳和银染结果显示条带主要集中在10～15 ku范围内,与2 EU/mL鲎试剂的最小凝集浓度是10.99 ng/mL,显色基质法测定其活性为9.82×10⁵ EU/mg。该试验提取、纯化的丙型副伤寒沙门氏菌LPS纯度较高,生物活性良好。     

奶牛Y精子膜蛋白的提取与分析

奶牛Y精子膜蛋白的提取与鉴定为深入研究Y精子特异膜蛋白在受精过程中的作用，开发经济、安全、高效的奶牛性别控制方法具有重要意义。本研究采用超声波破碎法将精子膜与精子分离，分离后的精子膜粗品采用蔗糖密度梯度离心法进行纯化。纯化的精子膜经膜蛋白提取液（去污剂）提取，透析浓缩。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）银盐染色，成功地提取到膜蛋白。BIO—RAD凝胶成像分析仪分析得知Y精子膜蛋白至少有10种，分子量范围为7．94KD-166．65KD，其中尤以15KD的蛋白含量最多。     

Selective extraction of outer-membrane proteins from membrane complexes of Pseudomonas maltophila by chloroform-methanol

An organic phase partitioning method is described for the selective purification of outer-membrane proteins (OMPs) from the total membrane complex of the opportunistic human and sheep pathogen, Pseudomonas maltophila. SDS-PAGE analysis confirmed that OMPs purified by chloroform-methanol treatment of the total membrane complex were not only identical to OMPs extracted from outer-membrane vesicles separated by sucrose gradient density centrifugation, but also possessed little or non-detectable levels of inner-membrane contaminants. Further analysis by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and immunoblotting established that OMPs extracted by organic phase partitioning with chloroform-methanol retained antigenicity and serological activity indistinguishable from OMPs that were present in outer-membrane vesicles resolved by isopycnic sucrose density centrifugation of sarkosyl-treated membrane complexes.