黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3 的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT-PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV-PE）全长RNA3.经核苷酸序列测定，明确PE分离物 RNA3全长2216 nt，含有2个开放阅读框（ORF），其中5'端的ORF（121-963 nt）编码279 aa的3a蛋白，3'端ORF（1260-1916 nt ）编码218 aa的CP蛋白.5'端非编码区（NR）长120 nt,基因间隔区（IR）长296 nt，3'端NR区含301个碱基.PE分离物编码的3a蛋白中最明显的特征是在136-141位有一个独特的VWCLSS区域.将CMV-PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关.     

侵染胡椒的黄瓜花叶病毒海南分离物全序列分析及亚组鉴定

对侵染海南胡椒的3个黄瓜花叶病毒分离物(CMV-WN1,CMV-DA,CMV-FT)的全序进行克隆和分析。CMV-WN1,CMV-DA,CMV-FT分离物RNA1全长分别为3 361,3 360,3 359个核苷酸(nt),编码1a蛋白;RNA2全长分别为3 044,3 048,3 046 nt,编码2a和2b蛋白;RNA3全长分别为2 217,2 224,2 216 nt,编码3a和CP蛋白。序列一致性比较结果表明,CMV-WN1,CMV-DA,CMV-FT的RNA1,RNA2,RNA3均与CMV亚组IB CMV-SD序列一致性最高,编码的所有蛋白的氨基酸序列一致性也均与CMV-SD序列一致性最高,其中除了2b氨基酸序列一致性低于90%外,其他蛋白的氨基酸序列的一致性均高于93.5%。RNA3的5'NTR结构分析以及RNA3 5'NTR核苷酸序列和CP氨基酸序列系统进化树分析结果表明CMV-WN1,CMV-DA及CMV-FT均属CMV IB亚组。CP系统进化树中CMV-WN1,CMV-FT与云南胡椒分离物CMV-YNP聚成一簇,而CMV-DA与海南胡椒分离物CMV-HNP独立形成另一个分支。     

云南省烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

以从云南省主要烟区烟草上分离到的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的RNA为模板,采用RT-PCR技术,对TMV云南分离物（TMV-YN）的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因及3’端非编码区和CMV云南分离物（CMV-YNa）的CP基因进行了cDNA克隆和序列测定。结果表明,TMV-YN的cDNA全长684个碱基（EMBL登录号为AJ239099）,通过GenBank进行同源性比较发现：其5'端的480个碱基为CP基因,编码159个氨基酸;3'端的204个氨基酸为非编码区;此CP基因与TMV-U1株系和TMV韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。CMV-YNa的CP基因全长657个碱基（EMBL登录号为AJ239098）,编码218个氨基酸;此CP基因与CMV亚组 I 的CMV-RB株系、CMV-117F株系和CMV-Y株系的核苷酸同源性分别为96%、93%和92%。     

烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物基因组全长序列测定和结构分析

[目的]对烟草丛顶病伴随RNA(TBTDaRNA)临沧分离物基因组全长序列进行测定,并对其进行结构分析。[方法]应用RT-PCR方法扩增烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物的基因组,并进行全长序列的测定,同时对烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物和龙陵分离物的基因组进行比较分析。[结果]烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物和龙陵分离物的基因组全长序列一致性为95.4%;ORF1a编码产物的氨基酸序列一致性为93.1%;ORF1b编码产物的氨基酸序列一致性为98.3%;3’端非编码区的核苷酸序列一致性为95.5%。[结论]该研究为研究TBTDaRNA的分子变异奠定了基础。     

黄瓜花叶病毒萝卜分离株卫星RNA的克隆及其与12个卫星RNA核苷酸序列的比较

对一株分离自萝卜（Raphanussativus）的黄瓜花叶病毒(CMV)卫星RNA(Rs)进行了cDNA克隆与序列确定，并与12个已知的卫星RNA序列进行了比较。结果表明：卫星RNARs的大小为368nt；该卫星RNA所比较的13个卫星RNA的大小分布为334～405nt，可分为3个组和4个亚组；CMV卫星RNA的序列同源性和分组与卫星RNA的大小并无直接联系。卫星RNA序列之间的连续缺失和插入均集中在90～255nt间几个邻近的区域。在卫星RNA二级结构中的非配对区序列、卫星RNA的5'端近80个碱基和3'端近45个碱基相当保守。由此推测CMV卫星RNA的理论长度可达446nt。序列结构的比较显示，CMV卫星RNA具有作为外源基因载体的潜力。     

甜菜坏死黄脉病毒不同分离物三联基因区及RNA3的序列分析

以来自于我国内蒙古、黑龙江和宁夏的3个甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）分离物为材料,采用反转录－PCR方法扩增不同RNA组分的基因片段,经cDNA克隆和序列测定后,与国外报道的BNYVV不同株系和来自于我国不同地区的BNYVV分离物之间进行比较分析。结果表明,BNYVV内蒙呼和浩特分离物（HU）RNA2中的42kD至3'端蛋白编码区长度为2435个核苷酸（nt),与法国F2分离物、德国G1分离物、日本S分离物的一致性分别为97．7％,94．9％;而黑龙江（HEI）、宁夏（NIN）和内蒙古包头分离物（BAO）RNA3的25kD蛋白编码区则与以往报道的内蒙呼和浩特分离物（HU）相应片段分别具有95．4％,93．4％和94．0％4的一致性,这些差异进一步证明了在BNYVV分离物之间广泛存在的分子变异,并可能与它们的致病能力相关。     

莴苣花叶病毒北京分离物基因组3＇末端序列分析

笔者通过RT-PCR方法对LMV北京分离物(LMV-BJ)基因组3''端1620nt的核苷酸片段进行了克隆和序列分析(GenBank登录号为EF423619)。所获片段含有NIb基因3''端的574nt,编码NIb C-端190个氨基酸;完整的CP基因,全长为834nt,编码一个由277个氨基酸组成的分子量约为30kDa的结构蛋白;3''非编码区含有209nt。通过序列分析软件将LMV-BJ与已经报道的法国分离物O(X97704)、法国分离物E(X97705),美国分离物(X65652),巴西分离物(AJ278854)和余杭分离物(AJ306288)基因组3''末端和CP基因的核苷酸序列与氨基酸序列分别进行了比较。     

侵染广州番木瓜的曲叶病毒DNA-A分子特征及生物学测定

 从中国广州番木瓜上检测获得双生病毒分离物GT，核苷酸序列测定表明，GT分离物 DNA-A全长2 769个核苷酸，编码6个ORFs，其中病毒链编码AV1（CP）和AV2两个ORFs，互补链编码AC1～AC4四个ORFs。DNA-A全序列、基因间隔区核苷酸序列及各ORF编码的氨基酸序列比较表明，GT与广东番木瓜曲叶病毒分离物GD2亲缘关系最近（96.7％）。生物学初步测定表明，该病毒可通过烟粉虱（Bemisia tabaci）传播到番木瓜、烟草和番茄植株上。     

黄瓜花叶病毒丹参株系外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从河北安国具有典型花叶症状的大田丹参叶片中分离到病毒病原 ,经过生物学接种、电镜观察和酶联免疫吸附测定表明该离物与CMV有较近的亲缘关系 (记为CMV DS)。从叶片中提取了该病毒的总RNA ,按照CMV外壳蛋白 (CP)基因前后保守区序列 ,设计合成了 1对特异引物 ,采用RT PCR法扩增了 780bp的全长CP基因的cDNA序列 ,将其克隆到pGEM T载体上 ,并进行序列分析。结果重组克隆序列长为 778bp ,含 1个开放阅读框架 (ORF) ,长度为 65 7nt,编码 2 1 8个氨基酸组成的蛋白。与国内外报道的CMV株系序列比较 ,CMV DS和亚组Ⅰ株系的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性为 93 3%～ 99 4%和95 9%～ 1 0 0 % ;而与亚组Ⅱ株系的核苷酸和氨基酸序列同源性仅为为 78 4%～ 79 0 %和81 2 %～ 83 0 % ,表明CMV DS与CMV亚组Ⅰ的株系较亚组Ⅱ株系同源关系更密切 ,将其划归为CMV亚组IB中 ,这是首次在丹参上发现的CMV株系。     

一株侵染掌叶半夏的大豆花叶病毒的全基因组序列测定和vsiRNA特征分析

【目的】探究侵染掌叶半夏（Pinellia pedatisecta）的大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）衍生的干扰小RNA（virus-derived small interfering RNA,vsiRNA）序列特征,为掌叶半夏抵御病毒的作用机制研究提供参考。【方法】以一株来自广西的具有典型病毒病症状的掌叶半夏为材料,取其褪绿斑驳的叶片采用TRIzol法提取总RNA,并进行小RNA深度测序（Small RNA Deep Sequencing）;利用快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE）和分段克隆技术获得病毒的全长基因组序列,利用MEGA 7.0将其与有代表性的病毒序列构建系统发育进化树并分析亲缘关系;以克隆测序获得的基因组序列作为参考进行vsiRNA特征分析。【结果】小RNA深度测序共获得4851249条高质量的读段（reads）,长度为21、22和24 nt的reads具有较高的丰度,占比分别为33.4%、13.7%和11.3%。该病毒分离物的基因组全长为9735 nt,编码3105个氨基酸,其基因组全序列与SMV HZ1分离物核苷酸序列相似性为86.93%,暂命名为SMV NN;系统发育进化树显示,SMV NN与分离自半夏的SMV HZ1分离物的亲缘关系最近。将vsiRNA定位到克隆测序后获得的SMV NN的基因组上,分析该病毒的vsiRNA特征,结果发现长度为21和22 nt的vsiRNA具有较高的丰度,病毒全基因组的正链和负链均能被vsiRNA覆盖,且分别在HC-Pro和P3蛋白编码区具有最强热点。【结论】掌叶半夏主要通过dicer样核糖核酸酶4（dicer-like ribonuclease 4,DCL4）和Argonaute蛋白1（Argonaute1,AGO1）对SMV的HC-Pro和P3蛋白编码区进行剪切,主要产生长度为21和22 nt的vsiRNA,从而抑制SMV在植株体内的复制。     

油茶14-3-3蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

以构建的油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子克隆技术,分离克隆1个14-3-3蛋白的全长cDNA序列,由1 156个核苷酸组成,5'非编码区57 bp,3'非编码区301 bp,开放阅读框长777 bp,编码259个氨基酸.该基因编码蛋白的分子质量为29.466 ku,等电点4.78,无信号肽序列,是非分泌蛋白,命名为Co-14-3-3a.推测的二级结构有9个α-螺旋,1个反平行的β-折叠,位于αC和αD之间.     

TMV蚕豆株系CP基因及3‘端非编码区序列分析与表达

根据烟草花叶病毒Ｕ１株系ＴＭＶ－Ｕ１序列，人工合成引物，通过ＰＣＲ扩增并克隆了烟草花叶病毒蚕豆株系（ＴＭＶ－Ｂ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和３＇端非编码区。ＤＮＡ全序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长４５９个碱基，编码１５１个氨基酸，３＇端非编码区全长２２４个碱基。与ＴＭＶ－Ｕ１株系相比，ＴＭＶ－Ｂ仅在ＣＰ基因上有一个碱基缺失，并导致ＣＰ基因提前终止，使其编码的氨基酸少７个。将ＣＰ基因及３＇端非编码区插     

口蹄疫病毒R株基因组序列分析研究

根据GenBank上发表的口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）全基因序列数据，设计了多对引物，采用RT-PCR的方法，分别对R株编码区和非编码区基因进行扩增，将各片段克隆至pMD18-T载体，进行核苷酸序列测定．按顺序拼接各基因的序列，将结果序列与GenBank上各FMDV毒株的序列进行比较和同源性分析．序列的比较和分析表明，R株编码区全长为6966个核苷酸，共编码2322个氨基酸；非编码区5’端内部核糖体结合位点（intemal ribosome entry site，IRES）长约450个核苷酸，3’非翻译区（untranslatable region，UTR）从TAA始至Poly（A）前长度为94个核苷酸，所测出Poly（A）尾长度为18个核苷酸．与GenBank世界流行毒株的序列比较，编码区核苷酸序列同源性为88％～90％，推导氨基酸序列同源性为88％～95％．     

中华蜜蜂mrjp3基因cDNA的克隆及序列分析

 以东方蜜蜂（Apis cerana）mrjp3基因部分片段为探针筛选中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）8日龄工蜂头部cDNA文库，得到120个阳性克隆。对这些阳性克隆进行进一步的筛选和序列测定，获得含有中蜂MRJP3 (AccMRJP3)cDNA的阳性克隆，对阳性克隆的插入片段进行测序，得到AccMRJP3的cDNA序列全长。中蜂MRJP3的cDNA全长为1 987 bp（包括10 bp长的poly A尾巴），包含一个长1 779 bp，编码593个氨基酸的ORF，在5'端和3'端各有一个长46 bp和160 bp的非编码区。类似于西方蜜蜂（Apis mellifera）和大蜜蜂（Apis dorsata），由AccMRJP3 cDNA编码的氨基酸序列也存在一个长片段重复区。但比较结果显示中蜂、西方蜜蜂、大蜜蜂MRJP3重复区之间存在一定差异。     

来源于西洋梨的苹果茎沟病毒分离物基因组分子特性研究

为了获得来源于西洋梨红贝雷沙寄主潜带苹果茎沟病毒(ASGV)分离物的基因组全长序列,并明确其分子特性,采用RT-PCR、RACE末端克隆及生物信息学方法,对ASGV分离物基因组全长进行序列测定,并对其序列特点进行分析。结果发现,来源于西洋梨的ASGV-HB分离物的基因组全长序列为6 496 nt(Gen Bank登录号:KU605672),含有2个开放阅读框ORF1、ORF2及2个可变区Ⅵ、Ⅶ。序列分析表明ASGV-HB与Gen Bank登录的18个ASGV分离物的基因组全长核苷酸序列同源性为80.6%~87.7%;ORF1和ORF2编码的氨基酸同源性分别为84.3%~92.3%和94.4%~98.7%;Ⅵ和Ⅶ可变区的氨基酸序列同源性分别为22.9%~68.8%和48.8%~92.2%;系统发育树分析显示,来源于不同国家的相同寄主的ASGV分离物聚集为同一分支。结果表明,ASGV的分子变异无地域相关性,具有一定的寄主选择性,研究结果为进一步探究ASGV的群体遗传进化机制及其防治提供了重要的分子信息。     

中国水稻条纹病毒两个亚种群代表性分离物全基因组核苷酸序列分析

 首次测定了中国水稻条纹病毒(RSV)常年流行区云南楚雄　(CX)分离物及病害暴发区江苏洪泽　(HZ)分离物全基因组核苷酸序列,其中CX 分离物全长为17 093　nts,HZ分离物全长为 17 150　nts。与已报道的日本T分离物全长序列(17 145　nts)相比较,CX分离物变异较大。3个分离物基因组结构组成一致,5′端和3′末端非编码区最为保守;7个编码区保守性次之;变异主要发生在IR上。同源性分析表明,HZ分离物与日本T分离物的亲缘关系较中国2个分离物间的亲缘关系更为接近,这表明HZ和CX分离物基     

西瓜花叶病毒2号山西分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法，扩增获得西瓜花叶病毒２号（ＷＭＶ－２）山西分离物ＣＰ基因，并克隆到ｐＵＣ－Ｔ载体中，核苷酸序列测定结果表明，山西分离物ＣＰ基因全长为８４６个核苷酸，编码由２８１个氨基酸组成的３１．５ｋＤａ蛋白。与国外已报道的ＷＭＶ－２ＣＰ基因相比，其核苷酸序列同源性为９２．８％～９３．９％，由此推导的氨基酸序列同源性为９５．４％～９６．４％，山西分离物外壳蛋白有４个氨基酸残基明显不同于其它分     

山西西葫芦花叶病病原鉴定与部分序列分析

利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)技术和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)方法对感病西葫芦进行了分子鉴定。序列测定及分析发现,具有明显花叶和斑驳症状的西葫芦受到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的侵染。为进一步明确黄瓜花叶病毒山西西葫芦分离物(CMV-XHL)的分类地位,克隆了CMV-XHL RNA3的外壳蛋白和移动蛋白基因全序列。通过序列比对分析,发现CMV-XHL CP核苷酸序列和氨基酸序列与CMV亚组ⅠB中CMV烟草分离物(CMV-SG)的相似性最高,分别为98.6%和99.5%;MP核苷酸序列和氨基酸序列与CMV亚组Ⅰ分离物的相似性最高,为93.2%~94.6%。MP和CP氨基酸序列系统进化分析表明,CMV-XHL与中国大多数CMV分离物聚为一类,属于CMV亚组Ⅰ中的成员。研究结果对西葫芦病毒病的防治提供一定的理论依据。     

虹鳟鱼trapd基因cDNA的克隆与序列特征分析

易位子相关蛋白δ(translocon associated protein delta,TRAPD)是作为内质网膜蛋白参与细胞内信号序列识别、新生肽链的修饰、转运通道的形成等过程.以虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,采用RT-PCR和RACE法分离和克隆虹鳟鱼trapd基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:FJ591154),序列全长949 bp,其中5'端非翻译区(UTR)长109 bp,3'端非翻译区(UTR)长336 bp,开放性阅读框(ORF)长504 bp,编码167个氨基酸,存在1个跨膜区.虹鳟TRAPD蛋白序列与斑马鱼、黑青斑河豚、大西洋鲑、斑点叉尾鲴、热带爪蟾、人和小鼠等脊椎动物的同源性均在80%左右,表明trapd基因在进化过程中是高度保守的.     

侵染西番莲的东亚西番莲病毒全基因组序列特征及TC-RT-PCR检测技术

【目的】 东亚西番莲病毒（East Asian Passiflora virus，EAPV）是西番莲（百香果）上危害严重的一种病毒。本研究对我国大陆地区东亚西番莲病毒福建分离物（EAPV-FJ）的全基因组序列进行测定，明确其基因组序列特征，并建立适用于EAPV特异性检测的TC-RT-PCR（tube capture RT-PCR）技术，旨在为该病毒的检测、监测及防治提供理论依据和技术支持。【方法】 采用小RNA深度测序技术结合分段克隆方法和RACE技术，测定EAPV-FJ的全基因组序列，对获得的序列进行序列特征、系统发育关系和重组分析；通过反应条件及反应体系优化，建立用于EAPV快速检测的TC-RT-PCR技术，测定其特异性和灵敏度，并应用建立的TC-RT-PCR技术对福建省西番莲果园采集的样品进行检测，同时利用普通RT-PCR检测方法进行验证。【结果】 测序获得的EAPV-FJ核苷酸序列全长为10 065 nt（不含polyA尾），含有一个长度为9 663 nt的开放阅读框，编码3 220 aa的多聚蛋白（polyprotein），经剪切后最终生成P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb和CP 10个蛋白。基因组序列一致性分析结果表明，EAPV-FJ全基因组与GenBank登录的4个EAPV代表分离物核苷酸序列一致性为80%—99%，其中与AO株系的越南分离物EAPV-GL1（GenBank登录号：MT450870）一致性最高，为99%；EAPV-FJ多聚蛋白核苷酸、氨基酸序列与GenBank登录的4个EAPV代表分离物一致性分别为79%—99%、82%—98%。基于多聚蛋白核苷酸序列的系统发育关系分析显示，EAPV分离物共分为两个类群（Group I为AO株系、Group Ⅱ为IB株系），未表现出明显的地理相关性，其中EAPV-FJ属于Group I，与已报道的越南分离物EAPV-GL1亲缘关系最近。重组分析结果表明，EAPV-FJ为非重组分离物。建立的TC-RT-PCR检测技术具有较好的特异性和灵敏度，仅能检测到感染EAPV的西番莲样品，而黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、西番莲潜隐病毒（Passiflora latent virus，PLV）、木槿潜隐皮尔斯堡病毒（hibiscus latent Fort Pierce virus，HLFPV）、芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus，TuMV）、大豆花叶病毒（soybean mosaic virus，SMV）、夜来香花叶病毒（telosma mosaic virus，TeMV）等其他病毒及健康样品均无法检测到；灵敏度最低可以检测到稀释10倍的EAPV西番莲病叶提取液原液，与普通RT-PCR检测方法的灵敏度相当。应用建立的TC-RT-PCR技术从福建省西番莲果园采集的60份疑似病样中检出EAPV共13份，该结果与普通RT-PCR检测结果一致。【结论】 首次报道了我国大陆地区EAPV全基因组序列，该分离物（EAPV-FJ）基因组结构与已报道的其他分离物一致，在系统发育关系上与越南分离物EAPV-GL1亲缘关系最近，且未检测到重组位点；建立的TC-RT-PCR检测技术具有操作简便、特异性强、灵敏度高和成本低的优点，能有效用于西番莲果园样品上EAPV的实际检测。