刺参体内RNA干扰方法的初步研究

以刺参溶菌酶基因(lysozyme gene,LYZ)为靶基因探索构建刺参体内RNA干扰体系。构建了3个刺参溶菌酶基因特异性的RNA干扰重组质粒,以刺参体腔液原代培养细胞为靶细胞进行筛选;分别以口腔注射和腹腔注射的方式以及不同的注射剂量对刺参LYZ进行体内RNA干扰,并运用qPCR技术测定刺参LYZ的表达量;最后,对刺参LYZ进行体内RNA干扰,并分别运用qPCR技术和比浊法测定刺参LYZ的表达量及其酶活性。结果显示:3种RNA干扰重组质粒的沉默效率分别为40%、45%、0%;体腔注射RNA干扰重组质粒时,各组织中LYZ的表达量均出现了显著的上升(P0.05),而从口腔注射时,体腔液和肌肉中LYZ的表达量均出现极为显著的下降(P0.01),而在管足中未出现明显变化;当其注射剂量为0.5μg和5μg时未对LYZ的表达产生有效的抑制作用;当注射剂量为10μg和25μg时,刺参体内LYZ的表达受到了明显抑制,但是注射剂量为25μg时,部分刺参个体出现吐肠现象;在转染12h后,刺参体腔液、肌肉、体壁、疣足和管足组织中LYZ的表达量开始下降,到第四天后开始回升。表明:只有从口腔注射RNA干扰重组质粒且注射剂量达到10μg时才能有效地抑制靶基因的表达;刺参体内RNA干扰具有系统性,可以在各个组织间相互传导。     

黄河鲶不同组织中RNA提取纯化方法研究

从组织提取RNA的完整性对于分子生物学研究是至关重要的。RNA提取方法有多种。采取异硫氰酸胍法从黄河鲶肌肉、血液、全鱼、肾脏、肝脏、卵巢中提取出完整RNA,结果表明,通过该方法所提取RNA质量高,效果好,可以用于进一步的分子生物学研究。     

长江华溪蟹组织RNA提取的研究

比较了长江华溪蟹Sinopotamon yangtsekiense心脏、肝胰腺、鳃和性腺等组织中提取总RNA的4种方法,同时比较了同一方法提取不同组织RNA的质量,总结出适合于蟹类组织RNA提取的方法.结果表明,TRIzol法提取效果最好,心脏总RNA质量最高.此外,实验中提取的总RNA污染少、完整性好,为以后进行cDNA合成、基因表达及定量分析等研究奠定了基础.     

草鱼成熟脂肪细胞总RNA提取方法研究

获得高质量的RNA是逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern blot以及转录组测序(RNA-Seq)等分子生物学研究的基础,由于草鱼脂肪细胞中油脂含量较高,从中提取高质量RNA存在困难。本研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成熟脂肪细胞为材料,通过增加离心和抽提次数等方式对传统总RNA提取方法进行优化,采用琼脂糖凝胶电泳、核酸定量分析及基因扩增等方法验证所得RNA的完整性、纯度及质量。结果表明,经此方法提取的草鱼成熟脂肪细胞总RNA的A260 nm/A280 nm比值在1.95到2.00之间,28S和18S条带完整,草鱼LPL和β-actin基因扩增条带清晰。认为采用本方法获得的草鱼脂肪细胞RNA样品质量较高,能够用于后续分子生物学研究。     

草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA提取方法的研究

基于传统的酸性酚—异硫氰酸胍—氯仿一步提取法,比较分析多种优化操作步骤,摸索出一种高质量提取体质量为80～150 g草鱼肠系膜脂肪组织总RNA的改良方法.试验结果显示,相较于肝脏、脾脏、肠道等脏器组织,草鱼肠系膜脂肪组织RNA丰度低,且极易在样品前处理阶段出现顽固性降解问题.探索发现,将取样量增至约30 mg,可提升R...     

锦鲤保护性组织RNA提取及引物扩增研究

从养殖锦鲤各种组织中提取完整的RNA,是分子生物学研究锦鲤应激表达、体色变异、生长发育等功能基因表达的关键实验.在不伤害养殖锦鲤个体健康的情况下,取用鱼体的鳍条、鳞片、鳃丝、血液4种保护性组织,可以最大程度地减少对珍贵锦鲤个体的损伤,并达到研究相关基因表达的目的.本研究利用TRizol法提取RNA,获得的各样品RNA条带完整、纯度高.结果表明,4种保护性组织提取的RNA经过逆转录反应,得到了高质量的CDNA.内标基因(β-actin)、热激蛋白基因(hsp 70)、金属硫蛋白基因(MT)扩增得到清晰的条带,通过NCBI数据上的BLAST比对证明,各序列的同源性在95%以上.利用本研究的方法,可以充分保护养殖锦鲤个体的完好性,用于进一步的分子生物学研究.     

锦鲤保护性组织RNA提取及引物扩增研究

从养殖锦鲤各种组织中提取完整的RNA, 是分子生物学研究锦鲤应激表达、体色变异、生长发育等功能基因表达的关键实验。在不伤害养殖锦鲤个体健康的情况下, 取用鱼体的鳍条、鳞片、鳃丝、血液4种保护性组织,可以最大程度地减少对珍贵锦鲤个体的损伤, 并达到研究相关基因表达的目的。本研究利用TR izo l法提取RNA, 获得的各样品RNA条带完整、纯度高。结果表明, 4 种保护性组织提取的RNA 经过逆转录反应, 得到了高质量的CDNA。内标基因( B- actin)、热激蛋白基因( hsp70)、金属硫蛋白基因(MT)扩增得到清晰的条带, 通过NCB I数据上的BLAST比对证明, 各序列的同源性在95%以上。利用本研究的方法, 可以充分保护养殖锦鲤个体的完好性, 用于进一步的分子生物学研究。     

仿刺参酸性磷酸酶的提取及粗酶性质研究

试验结果表明,仿刺参酸性磷酸酶的最佳提取缓冲液为 pH 7.5的Tris-HCl缓冲液,最佳沉淀条件为饱和度为80 %的硫酸铵.仿刺参体壁和肠道中的酸性磷酸酶最适反应条件均为:40 ℃,pH 4.0.Ca2+、Mg2+和Mn2+对体壁酸性磷酸酶有激活作用,而Fe3+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+对其有抑制作用,其中Cu2+的抑制作用最强;肠道酸性磷酸酶表现的特征与之类似,但Zn2+的抑制作用最强.PAGE电泳结果表明,仿刺参体壁和肠道中的酸性磷酸酶类型不同,肠道中有3种同工酶.     

装甲RNA在牡蛎中诺如病毒4种RNA提取方法比较研究中的应用

RNA提取是诺如病毒检测的关键步骤,而目前贝类中诺如病毒RNA提取、检测方法的比较与评价常囿于缺乏量值明确、无生物安全隐患的标准样品作为参考依据。本研究将前期制备的 GⅡ型诺如病毒装甲RNA (3.0×1010拷贝)作为标准样品,人工污染牡蛎(Ostrea gigas tnunb)消化腺匀浆物,用4种常见RNA提取方法：TRIzol试剂、Viral RNA Kit、High Pure Viral Nucleic Acid Kit、柱式病毒RNAOUT试剂盒,分别提取RNA,经实时荧光RT-PCR检测后,利用标准曲线进行定量分析,分别计算4种方法对装甲RNA的回收率。结果显示,对于匀浆样本,TRIzol法对装甲RNA的回收率最高(6.80±0.89)%,显著高于Viral RNA Kit (4.51±2.28)%,二者的回收率又显著高于High Pure Viral Nucleic Acid Kit (0.24±0.05)%与柱式病毒RNAOUT试剂盒(0.11±0.02)% (P?0.05);对于冻干样本,Viral RNA Kit对装甲RNA的回收率最高(8.71±0.17)%,显著高于TRIzol试剂(7.12±0.64)%,二者的回收率又显著高于High Pure Viral Nucleic Acid Kit (0.33±0.12)%与柱式病毒RNAOUT试剂盒(0.06±0.01)% (P?0.05)。研究表明,TRIzol试剂与Viral RNA Kit对牡蛎消化腺样本中人工添加的装甲RNA均有良好的回收效果,同时也提示装甲RNA可作为一种良好的标准样品用于不同RNA提取试剂盒方法的评价与比较研究。     

坛紫菜叶状体RNA提取方法的改良与比较

为提取高质量的坛紫菜叶状体总RNA,对常用的几种植物RNA提取方法(CTAB法、SDS法、异硫氰酸胍法)按照去除多糖、多酚的方法进行了改良,并对分离的总RNA根据吸光值、电泳图谱及RT-PCR检测等结果与两种试剂盒(离心柱试剂盒法,RNAiso法)的提取结果进行了比较。结果表明,SDS法、异硫氰酸胍法和RNAiso法3种方法提取的RNA纯度低,质量差,部分RNA已经发生了降解。而改良CTAB法和离心柱试剂盒法提取的总RNA质量可靠,完整性好,纯度高,并且成功去除了可能影响逆转录酶活性的物质,可以进一步应用于cDNA文库构建,基因表达分析等后续实验,但这两种方法各有优缺点,应根据实际情况选用合适方法进行坛紫菜叶状体总RNA的分离。     

仿刺参的微卫星标记

为了评价种质资源及基础生物学研究的需要,本文开发了仿刺参的微卫星标记。NCBI数据库中共有20个含有仿刺参微卫星的序列,从中选取8个设计引物,发现6个微卫星位点有多态性。不同的引物获得的等位基因数为3～9个不等,6个位点共获得了31个等位基因,每个位点平均获得5．2个等位基因。6个位点的平均观测杂合度（Ho）为0．3611,平均期望杂合度（He）为0．6402。位点AJMS004提供的多态性信息含量值较低,为0．4862;其他5个位点均在0．5以上。另外,还尝试了红海参（Parastichopus californicus）微卫星标记在仿刺参的通用性。实验结果表明,在较高的退火温度下,5对引物均能扩增仿刺参的基因组DNA并具多态性。5个位点共获得了22个等位基因,每个位点平均获得4．4个等位基因。5个位点的平均观测杂合度（Ho）为0．1733,平均期望杂合度（He）为0．4201。其中位点Psc2的多态性信息含量值最高,为0．8500。     

仿刺参的微卫星标记

根据1997-2000年东海23°30′~33°00′N、118°30′~128°00′E海域4个季节海洋调查资料,探讨了东海糠虾类的数量波动、相应的动力学过程及与渔场的关系。结果表明:东海糠虾类秋季丰度最高,均值为10ind.10-2m-3,春季次之(5ind.10-2m-3),夏季最低(1ind.10-2m-3);春季的漂浮囊糠虾(Gastrosaccus pelagicus)、夏季的极小假近糠虾(Pseudanchialina pusilla)、秋季的四刺端糠虾(Doxomysis quadrispinosa)和冬季的中华节糠虾(Siriellasinensis)对糠虾类总丰度变化的贡献较大。冬夏季不同优势种间对总丰度的贡献值较为接近,春秋季则有明显的差异。糠虾类春季和4季总丰度与底层水温线性相关;冬夏季与底层盐度相关;秋季与表层水温和10m层水温相关。东海糠虾类的数量波动,与东海沿岸河流的径流量,特别是长江径流势力消长有密切的联系,也与东海暖流势力从夏季到秋季维持一段时间有密切的关系。秋季糠虾类高分布区出现,对东海北部外海鲐鱼渔场和闽南-台湾浅滩渔场的形成有重要的意义。     

刺参休眠规律的研究

研究刺参休眠的临界温度及其休眠期间体特征的变化情况.试验在室内育苗车间和室外刺参养殖池塘同时进行,室内水温人工调控,池塘水温为自然水温,试验选择体质量为<0.5 g、0.5～1.0 g、2～3 g、5～10g、30～50 g和100～200 g等6种规格的刺参苗种作为试验对象;室内试验,通过人工控制水温,观察体质量为<0.5 g和0.5～1.0 g两种规格刺参的摄食情况;室外试验主要根据自然水温的变化,观察不同水温阶段体质量为2～3 g、5～10 g、30～50 g、100～200 g等4种规格刺参的生命活动规律及其生理生态特征的变化.结果显示:体质量<10 g的刺参未进入夏眠,体质量>30 g的刺参当水温升到>22℃时,逐渐进入夏眠,冬季当水温降到<1℃时,刺参逐渐停止摄食,进入冬眠状态.     

基于转录组测序挖掘仿刺参“化皮病”相关基因

为了寻找仿刺参(Apostichopus japonicus)养殖期间的"化皮病"关键调控基因,并分析这些基因所参与的信号通路,对本课题组前期已获得的仿刺参"化皮"I期(早期)、II期(中期)和III期(后期)3个阶段的病变及其同一个体正常体壁组织之间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行进一步分析。主成分分析(principal component analysis,PCA)结果显示,"化皮"II期病变组织与正常组织之间的差异最小,"化皮"I期与III期表达关系比较接近,"化皮"II期是一个"转折期"。KEGG富集分析结果显示,补体与凝血级联(Complement and coagulation cascades)通路和细胞外基质受体(ECM-receptor interaction)通路在"化皮"3个阶段都显著改变。通过构建"化皮"过程关键差异表达基因调控网络,发现Ig GFc-binding protein(Fc GBP)基因和Tenascin(TN)蛋白家族基因在"化皮"不同阶段参与到发生显著变化的信号通路。q RT-PCR验证结果显示,5个DEGs在仿刺参"化皮"不同阶段表达趋势与RNA-Seq结果一致,皮尔逊相关系数r值为0.7714。"化皮"过程关键调控基因的筛选将为抗逆品种选育以及"化皮病"的防控提供科学依据。     

pH胁迫对日本对虾非特异性免疫因子及RNA/DNA比值的影响

研究了PH胁迫对日本对虾血清非特异性免疫因子及对虾肌肉RNA/DNA比值的影响.结果表明,低pH胁迫组(pH 7.2)和高pH胁迫组(PH 9.2)总一氧化氮合成酶(TNOS)活力分别在3、12 h时达到最大;而诱导型一氧化氮合成酶(INOS)活力在3 h时达到最大值,随着胁迫时间的延长,酶活力逐渐降低,至72 h趋于稳定,并表现出高PH变化免疫适应能力较差的现象.两pH胁迫组酚氧化酶(PO)活力呈现峰值变化,在12 h时达到最大值,之后逐渐降低,至72 h后趋于稳定.溶茵酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力随着pH胁迫时间的增加而降低,同样表现出高PH变化免疫适应能力较差的现象.另外,PH胁迫条件下日本对虾的肌肉RNA/DNA比值显著低于正常对照组日本对虾肌肉的RNA/DNA比值,这可能是由于pH胁迫影响了对虾体内的物质代谢所致.     

异地刺参选育组合的稚幼参生长速率差异性分析

采用Duncan's新复极差测验分析方法,对青岛(Q)、烟台(Y)、威海(W)、日照(R)、长岛(C)的野生刺参群体进行了不同组合的选种繁育技术研究,以当地刺参自交作为对照组,对各组合的体质量日增长率和体长日增长率进行了比较分析.数据分析表明,各选育组的生长优势明显高于对照组.其中,Y(♀)×Q(♂)选育组的体质量日增长率和体长日增长率最高,分别为5.31%/d、3.66%/d,表现出良好的选育优势.研究表明,不同组选育组合之间剌参体长日增长率与体质量日增长率之间有一定的线性关系,但其之间的线性关系不明显.而Q(♀)×W(♂)和W(♀)×C(♂)选育组合的稚幼参体质量日增长率和体长日增长率分别为3.39%/d、2.11%/d;2.63%/d、3.05%/d,说明在同期的一定时间内体质量日增长率与体长日增长率不呈正相关.     

大黄酸在刺参体内的药代动力学研究

利用高效液相色谱(HPLC),对刺参Apostichopus japonicus体腔注射大黄酸(Rhein)后的药代动力学进行了研究。以5.33mg/kg的剂量给刺参体腔注射大黄酸,测定大黄酸在其体腔液、呼吸树、肌肉、体壁中的药物浓度-时间变化。结果表明,大黄酸在上述4种组织中的达峰时间(Tmax)分别为0.26、0.67、0.54、0.88h;消除半衰期(T1/2β)分别为6.24、26.1、71.48、8.93h;药时曲线下总面积(AUC)分别为69.29、105.6、132.38、20.99mg/L.h。除体壁中的大黄酸代谢规律符合一级吸收一室模型外,大黄酸在其他3种组织中均符合一级吸收二室模型。以上研究表明,体腔注射大黄酸后,药物在刺参体内吸收快,在各组织中能迅速达到峰值,消除半衰期长,代谢慢,主要经呼吸树排出体外。     

刺参养殖技术

世界海参养殖以刺参(温带种)和糙刺参(热带种)为主,中国、日本、韩国等国主要养殖刺参.我国60年代刺参育苗成功,70年代利用天然海域投放参苗人工增殖,80年代大水体高密度刺参人工育苗.