棉花热激蛋白(HSP)的研究及其应用前景展望

本文简要介绍了热激蛋白（ＨＳＰ）在作物中的研究概况；棉花ＨＳＰ产生的规律性及其与高温期蕾铃脱落关系的初步研究结果；并展望了ＨＳＰ在棉花等喜温作物高产栽培与育种中的应用前景     

棉花阿拉伯半乳糖蛋白基因的克隆、表达与染色体定位分析

陆地棉李氏超短纤维突变体(Li1li1)是显性单基因突变体,表现为茎秆、叶片卷曲,纤维短至6mm,其隐性纯合体(li1li1)则表现为株型和纤维发育都正常。对开花后10d的李氏纤维发育正常材料(li1li1)和超短纤维突变体(Li1li1)胚珠纤维混合体进行mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析,获得1条在李氏纤维发育正常材料中上调表达的差异片段。进一步通过5'RACE技术获得全长为621bp的cDNA,测序及DNA序列的生物信息学分析表明该cDNA片段与拟南芥编码阿拉伯半乳糖蛋白基因AGP14有52%相似性,故命名为GhAGP。表达特征分析表明,该基因在陆地棉根、茎、叶和纤维中组成性表达,在棉纤维中优势表达。基因组序列分析显示,该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中各有1个拷贝,在四倍体棉种陆地棉TM-1和海岛棉海7124中分别存在2个拷贝,表明A、D亚组中各有1个拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC1作图群体,将GhAGP基因的2个拷贝分别定位在四倍体棉花部分同源转化群染色体6和染色体25上。     

取食不同寄主植物对绿盲蝽热激蛋白AlHSP90表达的影响

绿盲蝽热激蛋白90基因AlHSP90是绿盲蝽体内重要的抗逆基因,参与绿盲蝽耐受高温、杀虫剂等胁迫反应。为了明晰绿盲蝽取食不同寄主植物后其体内抗逆基因的表达特征,本试验通过荧光定量PCR和Western杂交技术,重点分析AlHSP90基因及其蛋白在绿盲蝽取食不同寄主植物后的表达谱。结果表明:绿盲蝽雌、雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量显著高于取食其他寄主植物(P0.01);与对照四季豆相比,取食茼蒿之后AlHSP90表达量无显著变化(P0.05)。雌成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量分别比对照上升了1.77、1.74倍;而雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量则分别比对照上升了1.98、1.94倍。取食不同寄主植物之后,AlHSP90蛋白的表达谱结果与其基因的表达谱结果高度相似。绿盲蝽雌、雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90蛋白表达量显著高于取食其他寄主植物(P0.01);而取食茼蒿之后,AlHSP90蛋白表达量无显著变化(P0.05)。由此可见,AlHSP90基因是绿盲蝽适应棉花取食过程中重要的抗逆基因,并在绿盲蝽寄主转换过程中起到重要作用。     

甜菜热激蛋白基因BvHSP18.2的克隆和生物信息学分析

旨在通过基因克隆及生物信息学分析,预测甜菜小分子热激蛋白BvHSP18.2 (LOC104903994)的功能。以甜菜‘780016B/12 优’为试验材料克隆 BvHSP18.2,获得 BvHSP18.2 基因全长;通过 ProtParam tool、SWISS-MODEL、MEGA11 等对 BvHSP18.2 的理化性质、蛋白结构、多序列比对等信息进行分析。RT-PCR 扩增得到的 BvHSP18.2 基因全长为 962 bp,编码 158 个氨基酸,分子式为 C₉₂₈H₁₄₆₆N₂₆₆O₂₈₄S₆,属亲水性不稳定的小分子热激蛋白家族;该基因编码蛋白含13个磷酸化位点,α螺旋和无规则卷曲等主要构件。进化关系发现BvHSP18.2与藜麦、菠菜的s HSP同源性相似。同时,BvHSP18.2基因启动子区域具有参与防御和应激反应等顺式作用元件,推测其在甜菜生长发育和胁迫应答中发挥重要作用。本结果为进一步开展该基因的功能和遗传调控机制研究奠定了基础。     

玉米小分子热激蛋白ZmHSP17.7基因的克隆与功能分析

植物热激蛋白是一类代表性高温响应蛋白。以玉米种质POB21为材料,克隆了一个CDS序列长度为477 bp的小分子热激蛋白基因。该基因编码的蛋白含158个氨基酸,具有HSP20蛋白典型的ACD结构域,预测的等电点为5.36,分子量为17.746 k D,被命名为Zm HSP17.7。在水稻、拟南芥等植物基因组中都有其同源基因,进化和亚细胞定位分析表明,此基因属CI类小分子热激蛋白家族成员。Northern杂交分析表明,高温快速诱导Zm HSP17.7基因表达,15%PEG模拟干旱胁迫不诱导该基因表达,但在复合胁迫下干旱增强了高温的诱导效果。外源ABA也不影响该基因的表达。与野生型拟南芥相比,超表达Zm HSP17.7的转基因拟南芥在种子萌发和植株生长过程中表现出更强的高温和干旱耐受性,说明该基因可以在植物防御高温、干旱及复合胁迫中发挥一定作用。     

烟草细胞质小分子热激蛋白基因Nt- Hsp17.8的克隆及胁迫诱导表达特性分析

越来越多的研究表明,非生物胁迫影响植物的生长发育与栽培范围.为了通过转基因方法提高栽培番茄、马铃薯对热和干旱组合胁迫的抗性,利用RT-PCR结合RACE技术,从热处理的烟草叶片中分离出了细胞质小分子热激蛋白基因.分析表明,该基因cDNA全长876 bp,包含一个480 bp的开放阅读框,编码159个氨基酸,相对分子量约...     

棉花纤维特异/优势表达基因的染色体定位

 棉纤维是研究植物细胞伸长和细胞壁建成以及纤维素生物合成的优良模型,迄今为止,已经分离了许多纤维特异/优势表达的基因。为了便于这些基因的图位克隆使其能够应用于棉花纤维品质的改良中,本研究采用分离群体定位法和Blast分析法对这些基因进行染色体定位。利用陆地棉、海岛棉BC₁种间分离群体,将GhCFE定位在第6染色体,GhGLP1-250定位在第19染色体。Blast分析将11个基因定位到棉花染色体上。这些基因与棉纤维的伸长和细胞壁的合成相关,与这些基因连锁标记的获得有助于棉花纤维长度和强度的分子标记辅助选择。     

棉花早期热激处理与高温期蕾铃脱落关系的初步研究

研究了棉花早期热激处理与高温期蕾铃脱落的关系，结果表明：早期热激处理有助于高温期棉株体内产生更丰富的热激蛋白，从而提高棉株的耐热程度，降低脱落率达１．７～３．０个百分点。但不同的品种，早期热激处理的最适生长阶段不同品种有差异     

热激处理对棉苗子叶可溶性蛋白质种类和含量的影响

选用抗虫棉品种DP99B,彩色棉品种绿絮1号和棕絮1号,应用现代生物科学技术和手段,研究了棉花早期(萌动期、子叶期、1叶期)热激诱导产生的热激蛋白(HSPs)种类及其含量。结果表明:3个品种3个时期热激处理,处理后41.8 KD热激蛋白含量都增加。此外,DP品种不同时期热激处理后蛋白质含量增加的有3种,含量减少的有1种,含量不变的有3种,含量测不出来的有10种;LV品种热激处理后蛋白质含量增加的有3种,含量减少的有2种,含量不变的有3种,含量测不出来的有8种;ZH品种热激处理后蛋白质含量增加的有6种,含量减少的有2种,含量不变的有2种,含量测不出来的有5种。     

陆地棉三个WRKY基因的克隆及表达分析

WRKY转录因子可调控下游抗逆基因的表达,进而在植物生长发育以及对外界环境的反应中起着重要的调控作用,目前对棉花WRKY家族基因的研究比较少。本研究利用电子克隆的方法,从陆地棉品种山农圣杂3号中克隆得到了3个具有完整开放阅读框的棉花WRKY基因,聚类分析表明它们同属于WRKY家族中的第Ⅱ类。利用RT-PCR结果表明:250mmol/LNaCl盐胁迫和20%PEG6000干旱胁迫下同时诱导GhWRKY4的基因表达,GhWRKY5仅受干旱胁迫下的诱导,而GhWRKY6对这两种逆境胁迫都没有变化。     

陆地棉Ghkinesin13亚家族基因的克隆及表达特征分析

Kinesin家族是一类马达蛋白,它们能利用ATP水解所释放的能量驱动自身携带物质分子沿着微管运动,在细胞形成、细胞伸长等方面起着关键作用。本研究以拟南芥Atkinesin-13A蛋白序列作为探针序列,利用Blast比对从二倍体雷蒙德氏棉的基因组数据库中发现7个具有较高同源关系的基因。根据基因序列设计引物,利用RT-PCR技术从陆地棉纤维中分离出7个基因。依据7个基因与Atkinesin-13A和Atkinesin-13B的同源性高低,依次将其命名为Gh KIS13A1、Gh KIS13A2、Gh KIS13A3、Gh KIS13B1、Gh KIS13B2、Gh KIS13B3和Gh KIS13B4。生物信息学分析表明,7个Ghkinesin13均含有典型的KISC马达区域、ATP结合位点和微管结合位点,其马达区域属于中央马达。多重序列比对和进化树分析发现,这7个蛋白可被分为2个(Kinesin13A和Kinesin13B)亚类。实时荧光定量PCR结果表明,7个Ghkinesin13亚家族基因在棉花各组织中均有表达,但表达模式各不相同,其中Gh KIS13B4在纤维中优势表达,表明其在纤维发育过程中可能发挥着重要作用。     

水稻稻瘟病抗性基因定位、克隆及应用

稻瘟病是水稻生产中最严重的病害之一,严重影响水稻的产量和品质,由于稻瘟菌小种的变异快,垂直抗性基因难以持续控制稻瘟病的危害,因此,定位和克隆广谱持久的稻瘟病抗性基因,揭示其作用的分子机理,结合分子育种技术培育高产优质多抗的水稻新品种将是今后解决稻瘟病抗性育种最有效的途径.本文综述了水稻和稻瘟病菌之间的互作,稻瘟病抗性的分子机制,稻瘟病抗性基因定位,目前已经定位了73个稻瘟病质量抗性基因,其中9个稻瘟病抗性基因已经被克隆并进行了深入的研究,此外定位了至少11个QTL以及稻瘟病抗性基因克隆和功能分析,及其在水稻抗病育种中的应用.     

两个棉花HyPRP基因的分子鉴定与初步表达分析

从棉花胚珠和纤维cDNA文库中分离了2个编码杂合的富含脯氨酸的细胞壁蛋白（hybrid proline-rich protein, HyPRP）基因,命名为GhHyPRP1和GhHyPRP2,其编码蛋白分别含有327和137个氨基酸。蛋白质结构分析表明,二者都含有: N-端信号肽区、富含脯氨酸结构域、和C-端含有特定排列顺序和数目的半胱氨酸结构域。根据蛋白质结构域组成特点及与其他多结构域的富含脯氨酸蛋白质序列的同源性比较分析,将GhHyPRP1归为HyPRP A类蛋白质,将GhHyPRP2归为HyPRP B类蛋白质。RT-PCR分析显示GhHyPRP1在幼苗下胚轴中大量表达,而GhHyPRP2在胚珠中优势表达,暗示这2个基因可能分别在棉花不同组织发育中具有一定的生物学功能。     

三个陆地棉水孔蛋白基因的克隆与表达分析

从陆地棉SSH-cDNA文库的测序结果中得到一条具有完整ORF的陆地棉水孔蛋白基因序列,将其命名为GhAQP2。以该基因编码的氨基酸序列为探针,在棉花EST数据库经同源搜索得到2个相似性较高的EST,利用RACE技术获得其全长cDNA序列,将其基因命名为GhAQP3和GhAQP4。基因结构分析发现GhAQP2和GhAQP3各有4个外显子,3个内含子;GhAQP4有3个外显子,2个内含子。生物信息分析表明3个基因编码蛋白均含有6个跨膜区,2个NPA结构域,其氨基酸序列具备MIP超家族典型的蛋白保守区序列特征。多序列比对发现3个基因的氨基酸序列与其他物种PIP2类水孔蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。qRT-PCR分析表明,GhAQP2在纤维伸长后期优势表达,GhAQP3在下胚轴和子叶中高表达,GhAQP4在纤维伸长前期优势表达,推测3个基因在不同的组织中发挥作用。GhAQP2在20DPA优势表达,为研究该基因在纤维伸长向次生壁加厚期转化过程中的表达调控提供了重要信息。     

棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA的克隆、表达及染色体定位

腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。通过对高品质纤维陆地棉品系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的cDNA序列。该cDNA序列长1 598 bp, 利用5′RACE技术得到上游318 bp的片段,序列拼接获得全长为1 916 bp的cDNA序列, ORF为1 458 bp, 编码485个氨基酸, 其理论上的等电点pI＝5.69, 分子量MW＝53.2 kD。该基因在不同组织、器官中均表达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。根据Southern杂交结果推测GhSAHH基因在陆地棉基因组中为单拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC1作图群体, 将GhSAHH基因定位在第20号染色体上。     

棉花GhMADS12基因的克隆及其表达载体的构建

MADS-box基因是真核生物中一类重要的转录调控因子,调节着植物根、茎、叶到花的发育和果实的成熟。本研究以中棉所36花发育期均一化全长cDNA文库为基础,分离出一个棉花的MADS-box基因全长cDNA命名为GhMADS12。同时利用pBI121双元载体成功构建了GhMADS12基因的植物过表达载体,并利用基因枪轰击法瞬时表达载体,验证了载体的可靠性,为下一步转基因验证基因的功能奠定了基础。     

鹰嘴豆锌指蛋白基因ZE1的克隆及表达分析

利用一段从PEG胁迫的鹰嘴豆幼苗叶片所构建的cDNA文库中得到的EST序列,通过3'RACE方法克隆到一个鹰嘴豆C_2H_2型锌指蛋白基因ZF1,该基因不含内含子,编码一条244个氨基酸残基的多肽,含有两个典型的Cys2/His2锌指结构.其氨基酸序列含有一个可能的核定位型号,农杆菌介导的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明,ZF1蛋白位于细胞核内.半定量RT-PCR分析表明,ZF1在鹰嘴豆的根、茎、叶、花、幼荚和幼胚中均有表达,在茎和叶中表达较弱,为组成型转录因子.半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测结果显示,ZF1不但受高温及干旱诱导,而且还受6-苄基腺嘌呤(6-BA)、脱落酸(ABA)、乙烯利(Et)、赤霉素(GA_3)、吲哚-3-乙酸(IAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)和氧胁迫诱导.这些结果表明,ZF1基因可能作为一个核调控因子参与植物的生长代谢以及多种生物与非生物胁迫的应答.     

一个棉花GDSL脂肪酶基因的克隆与功能分析

GDSL脂肪酶与GXSXG脂肪酶是2个重要的脂肪酶亚家族。其中, GDSL家族脂肪酶具有水解酶活性, 能水解多种酯类物质。本试验根据新乡小吉无绒无絮(XinWX)和无绒有絮(XinFLM)近等基因系纤维起始期29K芯片竞争杂交结果, 选择了一个在纤维起始期具有极显著表达差异的EST序列(GenBank登录号为DR458916), 以该序列信息为探针, 利用电子克隆方法并进行cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆获得一个陆地棉GDSL脂肪酶基因(GhGDSL;GenBank登录号为KC186125)。该基因ORF长1065 bp, 编码354个氨基酸, 含有5个外显子和4个内含子。该基因在二倍体棉种基因组中含一个拷贝, 在四倍体棉种基因组中含2个拷贝。序列比对显示该基因在四倍体棉种的2个亚组中独立进化, 且D亚组比A亚组变异大。染色体定位显示该基因2个拷贝分别位于A4 (Chr. 4)和D4 (Chr. 22)染色体上。定量RT-PCR结果表明, GhGDSL在开花后3~10 d的纤维组织中表达量高, 其中在海7124中表达高峰在8DPA, 在TM-1中表达高峰从5DPA持续到10DPA。利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]的BC₁S₁群体开展GhGDSL功能与纤维、种子品质性状关联分析, 发现该基因A亚组的拷贝与种子脂肪含量存在显著相关(P=0.048);D亚组的拷贝与种子蛋白含量存在极显著相关(P=0.008)。推测GhGDSL基因功能与种子中脂肪、蛋白代谢相关, 同时也参与纤维伸长过程。