捻转血矛线虫扫描电镜的补充报告

本文对采自上海绵羊真胃的捻转血矛线虫进行扫描电镜观察。对该虫齿、颈乳突、排泄孔、肛孔、纵纹、横纹和交合刺超微结构作了补充描述,并讨论了交合刺构造。     

山羊捻转血矛线虫的诊治

介绍了山羊捻转血矛线虫的临床表现、剖检病变及实验室诊断,提出其预防与治疗措施,以期为该病的防治提供参考。     

山羊捻转血矛线虫与羊虱混合感染的诊治

米易县某羊场相继发生了以严重贫血,头部、下颌间,下腹部水肿为特征的疾病,根据临床症状,体表有羊虱及皱胃和小肠前段见到大量的淡红色线状虫体及实验室检查结果,确诊为山羊捻转血矛线虫与羊虱混合感染,采用两种驱虫药物对全群羊只进行治疗,控制了病情。     

羊捻转血矛线虫病的综合诊断与治疗

捻转血矛线虫病是羊常见的寄生虫病。某场羊出现精神不振,食欲下降,被毛粗乱,贫血,消瘦,颈下、胸前水肿等症状,通过发病情况调查、临床症状观察、剖检和进行虫种鉴定,确诊为羊的捻转血矛线虫病。通过皮下注射1％阿维菌素,治疗效果良好。     

捻转血矛线虫H11部分功能域基因的原核表达与分析

    生物信息学软件分析表明,捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)ZJ株的H11抗原基因含有4个糖基化位点与1个锌结合区,为分析这些功能域在H11天然抗原诱导的免疫保护中的作用,对H11部分基因进行克隆和表达.参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的H11基因序列设计引物,扩增H11开放阅读框670～1710 bp的部分基因序列,命名为HPS(H11 partial sequence).基因片段与表达载体pET-28b分别以NdeⅠ、XhoⅠ酶切后构建重组表达载体pET-28b-HPS,并将其转入大肠杆菌BL21中,提取质粒经PCR和酶切鉴定获得阳性质粒并对其进行测序.结果表明,扩增得到的目的基因片段为 1041 bp,与已发表的ZJ株和国外株参考序列比较,核苷酸同源性分别为100%和98.8%.将重组表达载体用IPTG诱导表达,表达产物利用SDS-PAGE和Western-blotting检测表明,HPS基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白的分子量约为37.34 kDa,诱导6 h的蛋白表达量可达到58.9%.     

绵羊混合感染捻转血矛线虫和美丽筒线虫的诊治

2008年11月以来河北北方学院动物科技学院病理实验室先后接到张家口坝上地区养羊户送来的以贫血、渐进性消瘦为主要特征的病羊,剖检发现其真胃内有捻转血矛线虫寄生,最多达2 120条。另在其食道黏膜内发现细长、乳白色的美丽筒线虫,共14条。漂浮法粪便检查时发现2种虫卵。一种虫卵内含16～32个胚细胞,卵壳薄,光滑稍带黄色,虫卵大小为(75～95)μm×(40～50)μm;另一种虫卵内含有幼虫,虫卵大小为(50～70)μm×(25～37)μm。经诊断为羊混合感染捻转血矛线虫和美丽筒线虫病。对羊群普遍用左旋咪唑片和丙硫咪唑口服驱虫,2周后羊群症状消失,病情得到控制。     

建立捻转血矛线虫单虫种分离株的方法

为获得捻转血矛线虫单虫种感染性三期幼虫(L3),以尾鞘长、尾鞘末端尾丝有无和尾丝长占尾鞘长的比例为依据,从自然混昆合感染有捻转血矛线虫的绵羊粪便中培养并分离该种线虫的L3,然后用6 000条分离的L3经口灌服3~4月龄绵羊。结果显示,绵羊感染后17 d从粪便中检出虫卯,105 d EPG(每克粪便虫卵数)达4 410,至168 d下降为2 010;人工感染10个月后将绵羊剖杀,从其皱胃中收集到捻转血矛线虫成虫2 261条。经鉴定,从人工感染绵羊的粪便中培养和分离出的L3符合捻转血矛线虫L3的特征。     

捻转血矛线虫H11基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将捻转血矛线虫H11基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后，用氯化锂法转化巴斯德毕赤酵母菌株X-33，通过含Zeocine^TM抗生素的YPD平板筛选出72个重组子。重组酵母用甲醇诱导后，经RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明捻转血矛线虫H11在巴斯德毕赤酵母中实现了表达。     

多重PCR检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性等位基因

 利用GenBank发表的捻转血矛线虫β微管蛋白基因组DNA序列设计2对引物,建立检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性的多重PCR方法,利用该方法检测我国不同地区捻转血矛线虫对苯并咪唑类药物的抗性,并用生物学检测验证。结果表明,建立的多重PCR方法在抗性检测上具有很强的特异性,澳大利亚抗性虫株只有F1和F3条带,上海敏感虫株只有F2和F3片段;序列分析证实抗性虫株编码β微管蛋白第200位氨基酸的密码子为TAC,敏感虫株为TTC。并且该法具有很高的灵敏性,检测基因组DNA的最低量为50 ng。生物学检测,澳大利亚抗性虫株丙硫苯咪唑LD50达0.54 ?g·ml-1,上海敏感虫株的LD50为0.0023 μg·ml-1,与多重PCR结果相符,说明多重PCR可以用于捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性的检测。利用该技术检测源于新疆石河子、伊宁,安徽五河,江苏南京、徐州等地的虫株发现,这些地理株均表现为敏感型,丙硫苯咪唑LD50在0.0023～0.0032 ?g·ml-1之间,提示我国捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性尚不严重。     

花垣与保靖山羊捻转血矛线虫感染情况调查研究

调查花垣、保靖2县不同饲养环境下武雪杂交山羊感染捻转血矛线虫的情况,结果表明:山羊寄生虫感染率很高,达68%,严重影响了山羊的生长发育。     

鸡球虫疫苗及其佐剂研究进展

    疫苗是捻转血矛线虫病防治研究中的热点之一,已有多种疫苗候选抗原得到鉴定,多数抗原在线虫的肠道表达,其天然提取物能够提供有效的免疫保护,减卵率可达70%～95%.由于糖基化作用、空间构象的错误折叠等因素的影响,疫苗候选抗原的重组形式不能为动物提供有效的免疫保护;免疫策略难以制定、佐荆难以选择也成为疫苗研制中的桎梏.因此,开发与天然提取物具有相似功能的转基因蛋白成为目前疫苗研究中的焦点,秀丽隐杆线虫表达系统和寄生性线虫细胞系的培育是研究中比较有潜力的两个方向;同时,RNAi技术等新方法的运用也加快了新的疫苗候选抗原的鉴定进程.     

应用RNA干扰技术抑制捻转血矛线虫H11基因研究

[目的]为了检测RNAi沉默H11基因能否模拟H11疫苗免疫效果.[方法]针对H11基因序列设计并合成特异性dsRNA,通过浸泡方式分别将dsRNA导入捻转血矛线虫感染性L3期幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析H11基因在L3期幼虫中的转录抑制效果,同时,将H11-dsRNA浸泡L3期幼虫24 h后感染绵羊,定期采集绵羊粪便检查虫卵数,第30 d后剖检绵羊皱胃,检查荷虫数的变化.研究H11基因的沉默对捻转血矛线虫减虫率和减卵率的疫苗免疫效果.[结果]实时荧光定量PCR检测表明:试验组中H11基因的相对含量显著低于对照组(P＜0.01),在浸泡72 h后,H11-dsRNA组基因的表达量仅为对照组的21.33;.绵羊体内干扰沉默效果显示,试验组H11干扰组虫卵减少率为41.02;,减虫率为39.6;.[结论]研究通过浸泡法导入的dsRNA能有效抑制H11基因的转录,同时H11基因的沉默与幼虫的发育密切相关,为捻转血矛线虫及其它寄生线虫的基因功能研究提供一种新的方法.     

捻转血矛线虫DNA疫苗的构建及山羊免疫保护性试验

 【目的】构建捻转血矛线虫DNA疫苗，并研究该疫苗对山羊的免疫保护效果。【方法】将捻转血矛线虫重要保护性抗原H11的编码基因分H11-1、H11-2和H11-3三部分，分别亚克隆到基因疫苗载体pcDNA4/His Max C中，用酶切反应、序列测定等方法鉴定重组疫苗。将纯化的DNA疫苗肌肉注射山羊后，用RT-PCR、Western blotting和ELISA方法检测疫苗在山羊体内的转录、翻译和诱导IgG的产生。第2次免疫后2W用10 000条捻转血矛线虫第3期幼虫攻击实验动物，检测山羊虫卵排出、虫卵孵化率、成虫数量等免疫保护性指标。【结果】获得了捻转血矛线虫H11 DNA疫苗，疫苗第1次免疫7d后在山羊肌肉组织中进行了转录，第2次免疫7 d后，DNA疫苗获得了翻译，并诱导机体产生了相应的抗体。与对照组比较，试验组山羊排出虫卵减少58.8%、虫卵孵化率减少75.3%、成虫减少68.2%。【结论】构建了捻转血矛线虫H11 DNA疫苗，该DNA疫苗对山羊具有较好的免疫保护效果。     

不同的体外培养条件对绵羊毛囊生长的影响

选择蒙古绵羊完整的生长期毛囊,分别培养于有血清及无血清的3种不同的培养基中,研究了不同的体外培养条件对绵羊毛囊生长的影响。结果表明,Williams E无血清培养基+胰岛素等相关药品培养液中培养的绵羊毛囊最接近于绵羊自然生长毛囊,表现出生长发育初期的结构特征,培养后期的毛囊尽管正常生长发育,但结构有了明显的变化。     

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。     

捻转血矛线虫H11蛋白提取及其氨肽酶活性分析

试验对体外培养的捻转血矛线虫L4期幼虫和自然感染的成虫的H11天然蛋白分别进行了提取和纯化,并进一步测定了其氨基肽酶活性及酶抑制剂敏感性,为利用捻转血矛线虫天然抗原进行疫苗研制进行了初步探索。结果表明,H11蛋白在L4期幼虫和自然感染成虫体内均有表达,且具有氨肽酶M(ApM)活性和氨肽酶A(ApA)活性,其酶活性能被EDTA及邻二氮杂菲等哺乳动物氨肽酶抑制剂所抑制。H11蛋白是寄生阶段虫体的一种酶类,在对H11蛋白进行操作时,应按照相应的酶处理方法进行,以防变性,影响抗原免疫效果。