盐度胁迫对刺参非特异性免疫酶的影响

盐胁迫后刺参的行为表现及免疫酶活性会发生相应变化,以达到适应盐度变化的目的。设定5个盐度梯度(18、23、33、36和40),分析盐度胁迫后刺参行为变化及不同响应时间下体腔液中碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）的活力变化。实验结果发现盐度增加和降低都使刺参的活动受到影响,低盐度胁迫比高盐度胁迫对刺参的影响大。碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性总体呈现先降低后升高,随着时间的延长逐渐恢复适应的趋势。盐度23溶菌酶活力显著高于盐度32的对照组;盐度为36时,溶菌酶活力在第1天最高,随后降低,维持2 d后,酶活力又开始升高,并高于盐度32的对照组水平;盐度为18、40时,酶活力显著低于对照组,并一直维持在较低水平。低盐18、23胁迫时,超氧化物歧化酶SOD酶活力明显低于对照组,且最低点均出现在第8 d。高盐36、40胁迫时,酶活力明显高于对照组,最高点分别出现在第5 d和第8 d。研究结果为刺参机体在盐度胁迫下的调节适应机制研究工作奠定一定的基础。     

κ-卡拉胶寡糖对仿刺参溶菌酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影响

采用10 g/L的两种κ-卡拉胶寡糖对仿刺参Apostichopus japonicus进行体壁注射刺激后,测定其体腔液中溶菌酶（LSZ）、碱性磷酸酶（AKP）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的动力学变化。结果表明：在注射κ-卡拉胶寡糖后的第1天,1、2号寡糖组的LSZ活性达到最高,分别是对照组的7.0和6.0倍,极显著高于对照组（P〈0.01）;AKP活性于注射后第2天增至最高,1、2号寡糖组的酶活性分别是对照组的1.9和2.6倍,前3天试验组的酶活性显著高于对照组（P〈0.05）;1号寡糖组的SOD活性于注射后第2天达到最高,然后逐渐下降,而2号寡糖组的酶活性第2天呈现增加,第5天达到最高,1、2号寡糖组的酶活性最高时分别是对照组的2.0倍和2.3倍,且极显著高于对照组（P〈0.01）。非参数检验分析表明,1、2号寡糖组3种酶活性变化趋势与对照组差异极显著（P〈0.01）,说明κ-卡拉胶寡糖具有增强仿刺参免疫活性的作用。     

κ-卡拉胶寡糖对仿刺参溶菌酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影响

采用10 g/L的两种κ-卡拉胶寡糖对仿刺参Apostichopus japonicus进行体壁注射刺激后,测定其体腔液中溶菌酶(LSZ)、碱性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的动力学变化。结果表明:在注射κ-卡拉胶寡糖后的第1天,1、2号寡糖组的LSZ活性达到最高,分别是对照组的7.0和6.0倍,极显著高于对照组(P<0.01);AKP活性于注射后第2天增至最高,1、2号寡糖组的酶活性分别是对照组的1.9和2.6倍,前3天试验组的酶活性显著高于对照组(P<0.05);1号寡糖组的SOD活性于注射后第2天达到最高,然后逐渐下降,而2号寡糖组的酶活性第2天呈现增加,第5天达到最高,1、2号寡糖组的酶活性最高时分别是对照组的2.0倍和2.3倍,且极显著高于对照组(P<0.01)。非参数检验分析表明,1、2号寡糖组3种酶活性变化趋势与对照组差异极显著(P<0.01),说明κ-卡拉胶寡糖具有增强仿刺参免疫活性的作用。     

异戊二烯对刺参急性毒性及其抗氧化酶和免疫酶活性的影响

为研究有机污染物对海洋生物的毒性影响,选择海洋环境中典型的异戊二烯作为暴露污染物,研究其对体质量为(5.23±0.96)g刺参Apostichopus japonicus的急性毒性及其体腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性的影响,并在实验室条件下,采用静水式生物毒性试验法开展了急性毒性试验,以及96 h亚致死效应的毒性试验。结果表明:异戊二烯对刺参的24、48、72、96 h半致死质量浓度分别为83.00、78.09、72.93、69.77 mg/L,安全质量浓度为6.98 mg/L;亚致死试验中,CAT活性受到的影响最大,表现为受到抑制作用,存在良好的剂量-效应和时间-效应正相关性;96 h时,中、低浓度异戊二烯对SOD活性具有显著的诱导作用(P<0.05),而高浓度异戊二烯对SOD活性具有极显著的抑制作用(P<0.01);ACP和AKP活性受到的影响较小,但48 h时两种酶均受到极显著的诱导作用(P<0.01),96 h时AKP活性受到显著的诱导作用(P<0.05);随着异戊二烯质量浓度的增加和时间的延长,刺参体腔液中4种酶活性受到不同程度的影响,因此,异戊二烯胁迫对刺参体内产生自由基导致氧化胁迫效应,以及对消化、能量代谢系统的影响可能是其重要的致毒原因,刺参体腔液中4种酶的变化体现了异戊二烯的致毒机制。本研究结果可为异戊二烯对海洋生物的生态毒理学方面的研究提供参考依据。     

异戊二烯对刺参急性毒性及其抗氧化酶和免疫酶活性的影响

为研究有机污染物对海洋生物的毒性影响,选择海洋环境中典型的异戊二烯作为暴露污染物,研究其对体质量为(5.23±0.96)g刺参Apostichopus japonicus的急性毒性及其体腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性的影响,并在实验室条件下,采用静水式生物毒性试验法开展了急性毒性试验,以及96 h亚致死效应的毒性试验。结果表明:异戊二烯对刺参的24、48、72、96 h半致死质量浓度分别为83.00、78.09、72.93、69.77 mg/L,安全质量浓度为6.98 mg/L;亚致死试验中,CAT活性受到的影响最大,表现为受到抑制作用,存在良好的剂量-效应和时间-效应正相关性;96 h时,中、低浓度异戊二烯对SOD活性具有显著的诱导作用(P0.05),而高浓度异戊二烯对SOD活性具有极显著的抑制作用(P0.01);ACP和AKP活性受到的影响较小,但48 h时两种酶均受到极显著的诱导作用(P0.01),96 h时AKP活性受到显著的诱导作用(P0.05);随着异戊二烯质量浓度的增加和时间的延长,刺参体腔液中4种酶活性受到不同程度的影响,因此,异戊二烯胁迫对刺参体内产生自由基导致氧化胁迫效应,以及对消化、能量代谢系统的影响可能是其重要的致毒原因,刺参体腔液中4种酶的变化体现了异戊二烯的致毒机制。本研究结果可为异戊二烯对海洋生物的生态毒理学方面的研究提供参考依据。     

乙酰甲喹对刺参幼参非特异性免疫、生长及抗应激能力的影响

选用初始体重为0.6 g左右的幼参,水体中分别添加0(对照组)、0.5、1.0、2.0、4.0和6.0 mg/L的乙酰甲喹。前69天每两天全部换水后,按照用药浓度泼洒药物一次。停药两周后经长途运输,考察其抗应激能力。实验结果表明:前30 d,各组刺参体壁中SOD酶活性都呈现增高趋势,2.0 mg/L组SOD活性达到最高,之后又呈现降低趋势;随着乙酰甲喹浓度的增加,各实验组刺参体壁中AKP和ACP酶活性呈现先增加后降低的趋势,2.0 mg/L和4.0mg/L组刺参酶活性最高;40 d后各实验组刺参体壁酶活性逐渐与对照组持平。所有实验组刺参的末体重、增重率和特定生长率均显著高于对照组(P0.05),4.0 mg/L组刺参末体重、增重率和特定生长率最高,显著高于其他各组(P0.05);4.0 mg/L组成活率为90.6%,显著高于其他各组(P0.05)。高浓度(6.0 mg/L)的乙酰甲喹导致幼参抗应激能力差。综合以上分析,认为刺参保苗期间,乙酰甲喹的适宜添加量为2.0~4.0 mg/L。     

几种理化因子对仿刺参体腔液补体溶血活性的影响

测定了仿刺参Apostichopus japonicus 体腔液补体溶血活性,并研究了几种理化因子对仿刺参体腔液补体溶血活性的影响.结果表明:仿刺参体腔液补体溶血活性为(68.8±13.5) U/mL;仿刺参体腔液在pH为7.5、Mg2+浓度为8 mmol/L的EGTA-Mg-GVB缓冲液和20 ℃条件下恒温水浴90 min时,其溶血活性最高;Mg2+对仿刺参体腔液补体的溶血活性有影响,苯甲基磺酰氟(PMSF)、酵母聚糖、甲胺和肼对仿刺参补体旁路溶血活性均有明显的抑制作用.     

蛭弧菌对草鱼免疫相关酶活性的影响

对草鱼基础饲料喷洒蛭弧菌制剂,喷洒量分别为0(对照),2 mg/g,5 mg/g,8 mg/g,10 mg/g,于第21 d,42 d分别测定草鱼血清和肝脏中免疫相关酶的活性。结果表明,AKP活性变化特点是:肝脏中AKP活性在第21 d,42 d时,实验组与对照相比,均有显著升高(P<0.05)。血清中AKP活性,第21 d时,实验组均呈现上升趋势,但与对照组相比无显著差异(P>0.05)。第42 d时,实验组与对照组相比,均有显著差异(P<0.05)。ACP活性变化特点是:血清中ACP活性,第21 d,42 d时,实验组与对照组相比,均有显著差异(P<0.05)。肝脏中ACP活性,第21 d,42 d时,实验组与对照组差异极显著(P<0.01)。SOD活性变化特点是:第21 d,42 d时,肝脏和血清中SOD活性均有小幅度升高,但是实验组与对照组相比,均无显著差异(P>0.05)。综合本次研究结果表明,饲料中添加蛭弧菌能对草鱼体内免疫相关酶系统产生积极地调理改善作用,使其非特异性免疫力得到改善与提高,结合养殖成本,建议其适宜添加量为5~8 mg/g。     

仿刺参体腔液中酚氧化酶活性的分析

在(22±1)℃下抽取体质量为95.0～105.0 g的仿刺参Apostichopus japonicas体腔液,制备体腔液及体腔细胞溶解上清液(CLS),分别测定其酚氧化酶(PO)活性,检测分析不同刺激物(CaCl2、MgCl2、LPS、SDS、Trypsin和甲醇)对酚氧化酶原(proPO)系统的激活效果,并比较了不同规格仿刺参体腔液的酚氧化酶活性。结果表明:仿刺参体腔液中的PO活性个体差异较大,平均为(146.90±55.60)U,体腔液与不同激活剂作用后PO活性均无明显变化;CLS中的PO活性为31.82 U,其在100 mmol/L MgCl2作用后PO活性大幅度提高,proPO比活为43.9 U,CLS与LPS、CaCl2和甲醇作用后PO活性无明显增加,与SDS和Trypsin作用后PO活性表现出一定的抑制。研究表明,仿刺参体腔液中的PO主要存在于体腔液中,CLS中的PO活性较低,proPO主要存在于体腔细胞中,可被Mg2+大幅度激活。52.4～68.5、20.7～24.4、4.9～5.6 g 3种规格的仿刺参体腔液中的PO活性分别为(42.18±7.62)、(34.10±9.28)、(33.29±7.42)U,表明不同规格仿刺参体腔液中的PO活性存在一定差异,总体呈现随规格的增大PO活性增强的趋势,其中100 g左右的仿刺参与3个较小规格的仿刺参体腔液中的PO活性存在显著性差异(P<0.05)。     

仿刺参体腔液中酚氧化酶活性的分析

在(22±1)℃下抽取体质量为95.0～ 105.0 g的仿刺参Apostichopus japonicas体腔液,制备体腔液及体腔细胞溶解上清液(CLS),分别测定其酚氧化酶(PO)活性,检测分析不同刺激物(CaCl2、MgCl2、LPS、SDS、Trypsin和甲醇)对酚氧化酶原(proPO)系统的激活效果,并比较了不同规格仿刺参体腔液的酚氧化酶活性.结果表明:仿刺参体腔液中的PO活性个体差异较大,平均为(146.90±55.60)U,体腔液与不同激活剂作用后PO活性均无明显变化;CLS中的PO活性为31.82 U,其在100 mmol/L MgCl2作用后PO活性大幅度提高,proPO比活为43.9U,CLS与LPS、CaCl2和甲醇作用后PO活性无明显增加,与SDS和Trypsin作用后PO活性表现出一定的抑制.研究表明,仿刺参体腔液中的PO主要存在于体腔液中,CLS中的PO活性较低,proPO主要存在于体腔细胞中,可被Mg2+大幅度激活.52.4～68.5、20.7 ～24.4、4.9～5.6 g3种规格的仿刺参体腔液中的PO活性分别为(42.18±7.62)、(34.10±9.28)、(33.29±7.42)U,表明不同规格仿刺参体腔液中的PO活性存在一定差异,总体呈现随规格的增大PO活性增强的趋势,其中100 g左右的仿刺参与3个较小规格的仿刺参体腔液中的PO活性存在显著性差异(P＜0.05).     

几种理化因子对仿刺参体腔液补体溶血活性的影响

测定了仿刺参Apostichopus japonicus体腔液补体溶血活性,并研究了几种理化因子对仿刺参体腔液补体溶血活性的影响。结果表明:仿刺参体腔液补体溶血活性为(68.8±13.5)U/mL;仿刺参体腔液在pH为7.5、Mg2+浓度为8 mmol/L的EGTA-Mg-GVB缓冲液和20℃条件下恒温水浴90 m in时,其溶血活性最高;Mg2+对仿刺参体腔液补体的溶血活性有影响,苯甲基磺酰氟(PMSF)、酵母聚糖、甲胺和肼对仿刺参补体旁路溶血活性均有明显的抑制作用。     

仿刺参体腔细胞染色方法的研究

通过改变固定时间、孵育时间、染色时间及温度、分色方式等染色条件,研究不同染料、不同染色条件对仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞的染色效果,并以观察体腔细胞内的颗粒、细胞核、细胞质和伪足的着色情况和细胞整体轮廓清晰程度为标准,筛选了适用于仿刺参体腔细胞的理想染色方法.结果表明:25℃室温下,采用滴片制片法,用湿盒孵育15～30 min,用甲醇固定1～2 min,用(φ)(Wright's):(φ)(Giemsa)=1:1的混合液染色1～2 min,水洗,用中性树胶封片,在此条件下对仿刺参体腔细胞的染色效果最好.     

仿刺参体腔细胞原代培养方法初探

以仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞为材料,分别用体腔液和MEM、L-15两种培养基进行原代培养,初步探讨了仿刺参体腔细胞培养的基本条件。结果表明：在18℃下封闭培养,体腔细胞在体腔液中直接培养能够贴壁、伸展,细胞呈球形和上皮样,但凝集现象严重;在合成培养基（MEM、L-15）中,体腔细胞凝集明显减少;与MEM培养基相比,体腔细胞在L-15培养基中贴壁时间长,伸展状态好,上皮样细胞较多,可培养至72h;培养基中血清的添加量与细胞的培养状态和可培养时间关系不明显。     

仿刺参体腔细胞原代培养方法初探

以仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞为材料,分别用体腔液和MEM、L-15两种培养基进行原代培养,初步探讨了仿刺参体腔细胞培养的基本条件。结果表明:在18℃下封闭培养,体腔细胞在体腔液中直接培养能够贴壁、伸展,细胞呈球形和上皮样,但凝集现象严重;在合成培养基(MEM、L-15)中,体腔细胞凝集明显减少;与MEM培养基相比,体腔细胞在L-15培养基中贴壁时间长,伸展状态好,上皮样细胞较多,可培养至72 h;培养基中血清的添加量与细胞的培养状态和可培养时间关系不明显。     

星斑川鲽自交F_1和杂交F_1代免疫相关酶的初步分析

[目的]研究星斑川鲽（Platichthys stellatus）自交F1代与星斑川鲽（Platichthys stellatus）♀×圆斑星鲽（Verasper variegates）♂杂交F1代各组织免疫相关酶的活性。[方法]比较星斑川鲽F1与杂交F1代肌肉、肝脏、脾脏和肠中3种重要的非特异免疫相关酶：酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性差异。[结果]杂交后代肌肉、脾脏、肠中ACP,AKP的活力都高于自交后代,肝脏中ACP,AKP的活性与自交后代无显著差异,SOD活性除肌肉组织中稍增加外,其他组织显著下降。[结论]该研究结果为星斑川鲽的杂交选育提供了理论依据。     

仿刺参体腔细胞单克隆抗体的制备及特性分析

应用杂交瘤技术制备了4株稳定分泌抗仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对其单克隆抗体的特性进行了分析。结果表明:单抗1C7和1H7主要结合淋巴样细胞,单抗2E8可与所有体腔细胞结合,单抗4E9主要结合球形细胞;单抗2E8、4E9与仿刺参体腔液具有明显的交叉反应,单抗1C7和1H7则与体腔液无交叉反应;单抗1C7和4E9属于IgG1,2E8属于IgG2a,1H7属于IgM亚型;单抗1C7和1H7均可识别相对分子质量为37 000的蛋白,单抗2E8可同时识别相对分子质量为37 000和61 000两种蛋白,单抗4E9可识别相对分子质量为108 000的蛋白。该单抗的制备为进一步研究仿刺参体腔细胞和体腔液之间的关系,体腔细胞的分类、分布、发生、分化及功能提供了新的工具。     

仿刺参体腔细胞单克隆抗体的制备及特性分析

应用杂交瘤技术制备了4株稳定分泌抗仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对其单克隆抗体的特性进行了分析。结果表明：单抗1C7和1H7主要结合淋巴样细胞,单抗2E8可与所有体腔细胞结合,单抗4E9主要结合球形细胞;单抗2E8、4E9与仿刺参体腔液具有明显的交叉反应,单抗1C7和1H7则与体腔液无交叉反应;单抗1C7和4E9属于IgG1,2E8属于IgG2a,1H7属于IgM亚型;单抗1C7和1H7均可识别相对分子质量为37 000的蛋白,单抗2E8可同时识别相对分子质量为37 000和61 000两种蛋白,单抗4E9可识别相对分子质量为108 000的蛋白。该单抗的制备为进一步研究仿刺参体腔细胞和体腔液之间的关系,体腔细胞的分类、分布、发生、分化及功能提供了新的工具。     

星斑川鲽自交F1和杂交F1代免疫相关酶的初步分析（摘要）

[目的]研究星斑川鲽（Platichthys stellatus）自交F1代与星斑川鲽（Platichthys stellatus）♀×圆斑星鲽（Verasper variegates）♂杂交F1代各组织免疫相关酶的活性。[方法]比较星斑川鲽F1与杂交F1代肌肉、肝脏、脾脏和肠中3种重要的非特异免疫相关酶：酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性差异。[结果]杂交后代肌肉、脾脏、肠中ACP,AKP的活力都高于自交后代,肝脏中ACP,AKP的活性与自交后代无显著差异,SOD活性除肌肉组织中稍增加外,其他组织显著下降。[结论]该研究结果为星斑川鲽的杂交选育提供了理论依据。     

仿刺参体腔细胞CD35的化学发光免疫检测

应用化学发光免疫检测(Chemiluminesent Immunoassay,CLIA)技术检测仿刺参Apostichopus japoni-cus体腔细胞CD35。单克隆CD35一抗抗体,用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗,选择对碘苯酚作为发光增强剂,鲁米诺和过氧化氢作为辣根过氧化物酶的底物;对照组用无菌海水代替一抗和二抗,进行化学发光免疫检测。结果显示:试验组发光值(1 321 596.00)和对照组(16 773.20)的发光值差异极显著(P<0.01);仿刺参体腔细胞膜上能够检测到CD35的存在,表明仿刺参体腔细胞膜上具有补体受体。     

仿刺参体腔细胞CD35的化学发光免疫检测

应用化学发光免疫检测（Chemiluminesent Immunoassay,CLIA）技术检测仿刺参Apostichopus japoni-cus体腔细胞CD35。单克隆CD35一抗抗体,用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗,选择对碘苯酚作为发光增强剂,鲁米诺和过氧化氢作为辣根过氧化物酶的底物;对照组用无菌海水代替一抗和二抗,进行化学发光免疫检测。结果显示：试验组发光值（1 321 596.00）和对照组（16 773.20）的发光值差异极显著（P〈0.01）;仿刺参体腔细胞膜上能够检测到CD35的存在,表明仿刺参体腔细胞膜上具有补体受体。