山东省免疫猪场猪伪狂犬病病毒分离鉴定及gE毒力基因的序列分析

为了解山东省使用Bartha-K61疫苗免疫猪场猪伪狂犬病(PR)流行的原因,本研究对2013和2014年采自山东省免疫猪场的PR疑似病料进行了猪伪狂犬病病毒(PRV)的分离鉴定,并对分离毒株的毒力基因gE进行了序列测定与分析。结果表明,共分离到12株PRV,TCID50介于10~(-7.1)/0.1mL与10~(-9.5)/0.1mL之间。12株PRV的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为99.9%~100.0%和99.7%~100.0%;与亚洲毒株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均高于欧美毒株。gE基因的氨基酸进化树分析表明,包括本研究分离的12株PRV在内的所有42株亚洲毒株属于GⅠ型,所有欧美毒株属于GⅡ型。这2个基因型之间分别在第58,105,148,178,180,214,215,470,500,505,518,522,569位氨基酸存在明显差异,可作为鉴别PRV欧美毒株与亚洲毒株的遗传标志。     

评估3种不同毒株的猪伪狂犬病活疫苗的免疫效果

猪伪狂犬病病毒变异株的流行对伪狂犬病的防控提出了严峻挑战,传统的疫苗对新流行毒株不能提供完全的保护。为评估3种不同毒株的活疫苗C株、HB2000株、Bartha-K61株的免疫效果,在某猪伪狂犬病gE抗体阴性猪场进行试验。结果显示,虽然3组疫苗1次和2次免疫后gB抗体阳性率达到100%,但是中和抗体的效价差异显著。从经典毒株HB-J和变异毒株CW的中和试验结果看,C株产生的平均中和抗体效价均为最高,显著高于HB2000株和Bartha-K61株,提示C株免疫效果优于HB2000株和Bartha-K61株,可以作为防控猪伪狂犬病的高效疫苗。     

新型猪伪狂犬病流行情况及净化措施

2011年11月份我国发生新型猪伪狂犬病疫情,导致中大猪、母猪出现典型的伪狂犬症状而死亡。目前,各地分离到的猪伪狂犬病毒(PRV)流行毒株基因组同源性非常接近。通过PCR检测新分离的伪狂犬病毒,测序后发现毒株出现基因变异,与Bartha株比较,其毒力相关基因RR基因第31~36位出现6个连续碱基的缺失,免疫原g B基因的第224~232位发生9个碱基GCCCCGGCC的缺失。毒力基因的变化导致PRV毒株的毒力明显增强。针对我国新型猪伪狂犬病的流行情况、发生原因以及该病对我国养猪业造成的危害进行了分析讨论,对新型伪狂犬病的毒株变异现象、临床新表现、病理新变化以及诊断方法作了阐述,并提出了新型伪狂犬病的防制和净化措施。     

2017-2019年广西猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gC、gG毒力基因分析

为了解2017-2019年广西猪伪狂犬病病毒(PRV)的流行和遗传变异情况,对2017年1月至2019年8月于广西各地区采集的284份疑似伪狂犬病发病猪临床样品进行检测和病毒分离,对分离毒株的gC、gG基因进行克隆、测序、遗传变异分析.被测样品中有85份阳性,阳性率为29.9％,从中共分离到10株PRV毒株,其中9株为...     

2013—2018年广西地区猪伪狂犬病病毒gB、gE与TK基因遗传变异分析

为了解广西近年猪伪狂犬病（PR）流行情况及猪伪狂犬病病毒（PRV）流行株gB、gE、TK基因的遗传变异特点,于2013-2018年采集广西各地区疑似PR发病猪靶组织714份,进行PRV的PCR检测及病毒分离鉴定,并运用DNAStar、MEGA 6.0等生物学软件对分离毒株gB、gE、TK基因进行遗传变异分析。结果显示：样品检测阳性率为24.5%（175/714）,共分离获得PRV流行株38株。受检猪群普遍存在PRV感染,经典毒株及变异毒株并存,而且以变异毒株为主。广西流行株不同亚群PRV在gB、gE、TK基因上均存在相同的氨基酸变异特点,与国内变异株亲缘关系较近。推测广西流行株存在两种不同重组变异形式产生的PRV重组毒株,分别为疫苗株gB基因和变异株gE基因重组产生的重组毒株,以及经典株的TK基因被疫苗株（HB98）的TK基因替换而产生的重组毒株。近年广西受检猪场较普遍存在PRV感染,而且PRV流行株以变异毒株为主,可能存在两种不同重组变异形式产生的重组毒株,猪场需重视及实施针对性PR免疫防控计划。     

猪伪狂犬病病毒FZ-2012株的分离鉴定及其gE基因的遗传演化分析

从福建省某猪场采集疑似猪伪狂犬病的病料接种PK-15细胞,通过PCR法、动物试验证实所分离的病毒为猪伪狂犬病毒(PRV),命名为FZ-2012,经测定该病毒株TCID50为10-9.40/0.1mL。根据Gen Bank已公布的PRV gE基因序列设计了1对特异性引物,将PCR扩增片段进行克隆测序,与国内外已发表的2012年以来15个新分离毒株、11个经典毒株进行同源性比对分析,并构建遗传进化树。结果表明:FZ-2012株gE基因序列全长1740 bp,编码579个氨基酸,与新分离毒株gE基因氨基酸序列的同源性为97.6%~99.3%,与经典毒株的氨基酸序列同源性为95.0%~98.6%;遗传进化关系表明,FZ-2012毒株与新分离毒株同属一分支,而与经典毒株分属2个不同分支。本研究首次报道福建省存在PRV新流行毒株,为丰富福建省猪伪狂犬病的分子流行病学和开发猪伪狂犬病新型疫苗奠定基础。     

猪伪狂犬病活疫苗(SA215株,扑伪优)对新流行伪狂犬病病毒具有良好的免疫保护力

<正>2011年至今,全国范围内的猪伪狂犬病暴发后,国内学者分离到大量新毒株,如HeN1及TJ株。基因组分析结果表明,新毒株与以往分离的PRV毒株相比存在转换、插入和缺失变异的特点。实验结果证实SA215对伪狂犬病经典毒株和新流行毒株均具有优异的免疫保护能力,能有效保护猪只免受猪伪狂犬病野毒的感染。     

伪狂犬病病毒FS-2015株gE和gB基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒(porcine pesudorabies virus,PRV)gB和gE基因变异及遗传演化情况,本研究针对PRV FS-2015野毒株,应用"蚀斑法"对组织病料中病毒进行三轮纯化,应用全长扩增引物对FS-2015株gB和gE基因进行全基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,PRV FS-2015株的gB、gE基因与国内外PRV参考毒株的核苷酸同源性分别为97.0%～100.0%和97.5%～99.7%,氨基酸同源性分别为96.4%～100.0%和95.3%～99.7%。氨基酸变异位点分析表明,FS-2015株的gB和gE基因均有位点突变和缺失。遗传进化分析表明,FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ-YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系较近;与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha和Yangsan株属于不同分支,同源性较低,亲缘关系较远。从PRV FS-2015毒株与国内外经典毒株和当前国内流行的变异毒株的分析结果可知,PRV FS-2015毒株发生了一定的变异,属于当前国内流行变异毒株。本研究结果为广东省伪狂犬病分子流行病学调查、伪狂犬病的防控和疫苗株挑选工作提供参考数据。     

经典Bartha-K61株猪伪狂犬病疫苗临床应用效果研究

正猪伪狂犬病是危害养猪业的一种重要传染病,它严重危害着国内养猪业的发展。自2011年以来,该病在我国多个地区大面积流行,伪狂犬病毒株变异,经典Bartha株的使用效果让很多养殖户怀疑,本研究以连续使用经典伪狂犬疫苗一年以后的规模养猪场为研究对象,采集不同阶段猪群的血清样本,进行血清学检测,以评估经典毒株伪狂犬疫苗的临床应用效果。     

与猪同群饲养山羊暴发伪狂犬病的确诊及山羊源伪狂犬病病毒JC株的分离鉴定

2015年11月云南省江川县某养殖户家中与育肥猪同群饲养的136只山羊相继暴发以发热、食欲减退、烦躁不安、全身剧烈瘙痒及高死亡率为特征的疫情。为及时确诊病因,我们采集病死山羊内脏及大脑组织进行山羊关节炎/脑炎、狂犬病及伪狂犬病病毒核酸检测,同时进行病毒分离培养、鉴定,并采集育肥猪血清样品进行伪狂犬病病毒gB及gE抗体检测。结果显示,从病死山羊大脑组织中扩增出约810 bp大小的伪狂犬病病毒gE(US8)基因目的条带,并分离获得1株山羊源伪狂犬病病毒流行毒株,命名为JC株,毒株滴度为TCID_(50)=10~(-7.375)/100μL,其gE基因序列在NCBI GenBank中的比对结果显示,其与2014年的Qihe547(KU056477)株、2013年的HLJ8(KT824771)株、2012年的HNX(KM189912)及HeN1(KP098534)株的gE基因核苷酸序列同源性均达99%。JC株与云南伪狂犬病病毒猪源毒株FY、LL、XD及XSBN株的gE基因序列比对结果显示,其仅在290位置处有1个碱基C的插入,在1 469～1 471位置处有3个碱基GAC的缺失。JC株与云南猪源毒株30938、LL、XD及XSBN株的TK、gC基因序列比对结果显示,其TK基因序列完全相同,仅在gC基因序列58位置处有1个碱基的变异(G→A),其余序列完全相同。将JC毒株接种家兔、昆明小白鼠及经伪狂犬病病毒gE、gB抗体呈阴性的健康山羊后,均复制出典型的伪狂犬病病例。采集的16份猪血清样品伪狂犬病病毒gB及gE抗体检测结果均为阳性。根据流行病学、病原学研究及血清学检测结果分析,确诊引起此次山羊疫情的病因为山羊与猪同群饲养后,受伪狂犬病病毒隐性带毒猪传染所致。     

猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断、血清学调查以及控制措施

目的为某规模化猪场猪伪狂犬病病毒野毒株感染防控工作提供科学的免疫防控方案。方法对某发病猪群（采用Bartha-K61经典毒株疫苗进行了猪伪狂犬病免疫）进行流行病学调查,并采用ELISA方法检测其猪伪狂犬病gB抗体和gE抗体水平。结果根据调查、解剖和血清抗体检测结果,初步确诊该发病猪群为猪伪狂犬病野毒感染。通过采取紧急免疫伪狂犬病HB2000毒株疫苗、调整免疫程序和配合药物治疗等措施,育肥猪死亡率从2.56%降低至0.60%;除了4周龄及12周龄猪群外,其余猪群伪狂犬病野毒抗体水平全部下降;种公猪、8周龄、10周龄、14周龄猪群伪狂犬病野毒抗体阳性率均为0。结论Bartha-K61经典毒株疫苗并不能提供完全的保护力,通过紧急免疫与流行毒株同源性较高的HB2000毒株疫苗,加强生物安全管理工作,能够有效控制猪伪狂犬病野毒感染。     

广西地区猪伪狂犬病病毒gE基因的序列分析

探讨广西地区近期流行猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的变异规律,以及与国内外毒株的基因差异性,为制定有效的猪伪狂犬病防控措施提供科学依据。对广西不同地区流行的PRV gE基因进行克隆和序列测定,并与国内外PRV毒株的gE基因进行同源性比对分析,构建遗传进化树。广西地区流行的PRV与广东Fa株、湖北HD株的gE基因核苷酸的同源性与编码氨基酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.7%;广西地区流行毒株间gE基因同源性达99.5%~99.8%,推导氨基酸序列同源性为98.8%~99.7%,广西地区近期流行PRV毒株的变异不明显。4株PRV毒株与近年国内分离的毒株ZK、NY、QBA、HNXX、MZ1处于同一分支上,遗传关系较近;而与国内经典株Ea、GDSH遗传关系稍远,与国外分离株Yangsan、NiA3、Becker、Rice处于不同的遗传分支,保持较远的亲缘关系。4株PRV gE基因的48位点氨基酸和其中的GXNN1、GXBH1的496位点氨基酸增加1个天冬氨酸的插入,具有变异株的特征。广西地区流行的PRV毒株属于目前我国主要流行的变异株,其氨基酸的插入将对变异株的分子流行病学调查提供重要的参考。     

2018年伪狂犬病病毒的流行特征及其遗传变异分析

为了了解当前伪狂犬病病毒（PRV）在我国猪群中的流行现状及其遗传变异情况,本研究利用PCR的方法对2018年1-12月来源于我国28个省、市、自治区的1 328份疑似猪伪狂犬病发病猪的组织样品开展了PRV-gE的检测及病毒的分离鉴定,同时针对所分离的病毒的gB、gC和gE基因进行PCR扩增和DNA测序,并展开遗传变异分析。结果显示,共有92份样品为PRV-gE基因检测阳性,阳性检出率为6.93%。从92份PRV-gE阳性样品分离到13株PRV。分别基于gB基因部分片段、gC和gE基因进行遗传变异分析发现13株PRV与我国2012年以后流行的毒株（如HeN1等变异株）亲缘关系较近,而与2012年以前所分离的毒株（如Ea等经典毒株）的亲缘关系较远;此外,绝大多数中国分离株与国外分离毒株（如NIA-3、Bartha、Kaplan等）在遗传进化树中位于不同的进化分支;相对于国外分离株及国内早期流行的经典毒株而言,13株PRV分离株的gB、gC和gE蛋白中均存在许多特征性的氨基酸位点变异。本研究对于了解我国PRV流行现状及当前流行的PRV毒株的生物学特征具有十分重要的意义。     

金宇生物伪狂宁疫苗上市

正2018年3月7日金宇生物技术股份有限公司推出了重磅新品——旗下子公司扬州优邦生物药品有限公司的猪伪狂犬病耐热保护剂活疫苗(C株)"伪狂宁"。该疫苗毒株采用在2011年我国本土分离的自然致弱毒株C株,其与当前流行毒株同处基因Ⅱ型,抗原含量为每头份≥106.0TCID50;首次将ST传代细胞悬浮培养技术应用到猪伪狂犬病疫苗制作,降低批间差、减少血清使用和外源病毒风险;使用纳米水性佐剂,可喷鼻亦可肌注;应用耐热保护剂,实现     

猪伪狂犬病病毒LN1301株分离鉴定及其gE和TK基因的变异分析

通过查明辽宁省猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)的传染来源及其病原变异情况,为建立有针对性的诊断与防制方法提供基础依据。采集辽宁某猪场疑似伪狂犬病病死仔猪的脑组织病料,应用非洲绿猴肾(Vero)细胞分离培养,通过电子显微镜观察、病毒中和试验、聚合酶链反应、病毒TCID50测定和动物试验对所分离的病毒进行鉴定。结果确认从辽宁省成功分离到1株猪伪狂犬病病毒野毒株,暂命名为PRVLN/1301株。应用猪伪狂犬病毒(PRV)标准株设计引物对分离到的病毒进行gE和TK基因PCR扩增、T-A克隆、测序,成功扩增克隆出猪伪狂犬病病毒辽宁株PRVLN1301的主要毒力基因gE和TK基因序列。通过系统进化树分析表明该毒株与国内外参考毒株的同源性均在97%以上,核苷酸序列分析结果显示所分离的PRVgE基因存在第995位点由C-A的突变、第999位点由T-G的突变,氨基酸序列比对结果显示存在1个氨基酸L-Q位点的变化,即由亮氨酸变为谷氨酰胺,TK基因没有变异和缺失。说明该毒株与其他地区毒株为同一来源,但存在部分位点的变异。     

伪狂犬病病毒FS-2015株gE和gB基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒（porcine pesudorabies virus,PRV）gB和gE基因变异及遗传演化情况,本研究针对PRV FS-2015野毒株,应用"蚀斑法"对组织病料中病毒进行三轮纯化,应用全长扩增引物对FS-2015株gB和gE基因进行全基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,PRV FS-2015株的gB、gE基因与国内外PRV参考毒株的核苷酸同源性分别为97.0%~100.0%和97.5%~99.7%,氨基酸同源性分别为96.4%~100.0%和95.3%~99.7%。氨基酸变异位点分析表明,FS-2015株的gB和gE基因均有位点突变和缺失。遗传进化分析表明,FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ-YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系较近;与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha和Yangsan株属于不同分支,同源性较低,亲缘关系较远。从PRV FS-2015毒株与国内外经典毒株和当前国内流行的变异毒株的分析结果可知,PRV FS-2015毒株发生了一定的变异,属于当前国内流行变异毒株。本研究结果为广东省伪狂犬病分子流行病学调查、伪狂犬病的防控和疫苗株挑选工作提供参考数据。     

2015－2020年天津地区猪伪狂犬病病毒gB、gC、gE基因遗传变异分析

为掌握天津地区猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）的流行及遗传变异情况,本研究对2015－2020年天津地区分离的20个分离株的gB、gC和gE基因进行扩增、测序,并与参考毒株序列进行比对分析。相似性分析结果显示,分离株与2012年后中国变异株相比,3种基因核苷酸及编码氨基酸序列相似性分别为：gB基因均为99.9%~100%;gC基因为99.7%~100%和99.4%~100%;gE基因为99.7%~100%和99.6%~100%。遗传进化和序列比对分析结果显示,依据gB、gC、gE基因绘制遗传进化树均可将PRV毒株分为GⅠ型和GⅡ型,天津分离株属于GⅡ型;其中19个分离株与PRV变异株遗传关系较近,属于同一亚分支,并存在相同的氨基酸变异位点;另外1个分离株（TJBD6株）gB和gE基因与PRV变异株遗传关系较近,氨基酸变异位置与PRV变异株一致,但其gC基因与经典株Ea株遗传关系较近,且核苷酸和氨基酸序列相似性为100%。上述结果表明,2015年以来天津地区流行的PRV毒株存在经典株和变异株2种类型,其中变异株为主要流行株。本次研究初步调查了天津地区PRV分子流行特征,可为猪伪狂犬病防控提供依据。     

猪伪狂犬病病毒NP株gE、gI基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV) gE、gI基因的序列设计了2对引物,对PRV NP株的gE、gI基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序,测序结果与预期的PRV gE、gI基因片段相符。同源性比对分析结果显示,PRV NP株gE、gI基因推导的氨基酸序列与国内分离的PRV毒株的同源性分别为95.7%~99.8%、89.9%~99.5%。遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRV NP株的gE氨基酸序列发生变化的位点与2012年国内分离到的PRV流行株相同,从而推测NP株为PRV变异毒株,本研究为PRV的流行病学调查分析奠定了基础,也为开发科学、有效的新型猪伪狂犬病(PR)疫苗提供科学依据。     

猪伪狂犬病病毒变异株GD株的分离鉴定及TK和gE基因的进化分析

为了解猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)流行变异毒株的病原学特性及分子遗传变异特点,本研究从广东省某疑似暴发猪伪狂犬病的猪场采集的病料中分离到一株PRV毒株,命名为GD株。该病毒在PK-15细胞中能够产生典型的PRV细胞病变,病毒滴度可达109.0 TCID50/mL。将病毒感染KM SPF小鼠,接种小鼠在4 d内全部死亡,并且均出现典型的PR症状。序列比对结果显示,PRV GD株的TK和gE基因与国内外PRV参考株的核苷酸同源性分别为99.4%～100%和97.6～99.9%,氨基酸同源性分别为99.4%～100%和95.5%～99.8%。基于gE基因的遗传进化分析发现,PRV GD株与国内近几年分离鉴定的流行变异毒株位于同一分支上。与经典株相比,PRV GD株的gE蛋白氨基酸序列在48和496位均有1个天冬氨酸(D)的插入,符合PRV变异株的典型特征。本研究成功分离到一株PRV变异株,为PRV流行变异毒株的防控和新型疫苗的研究提供一定的科学依据。     

山东省分离强毒株猪伪狂犬病病毒SA株TK基因结构与进化分析

对山东省分离强毒株猪伪狂犬病病毒SA株TK基因进行了克隆和部分序列测定,并分析比较了该序列与国内外主要流行毒株伪狂犬病病毒Ea株、Min-A株、LA株、Kroea株、Kaplan株、SH株的同源性.结果表明:核苷酸序列的同源性分别为99.0%、99.1%、98.9%、99.0%、98.3%和74.4%;氨基酸序列的同源性分别为98.7%、98.4%、98.4%、98.7%、98.3%和74.8%;猪伪狂犬病毒SA株TK基因具有疱疹病毒胸苷激酶催化结构域的保守氨基酸共有的对应于这两个亚结构域的特征基序,其蛋白的二级结构由α-螺旋(45.38%)、β-折叠(14.46%)、β-转角(6.02%)和无规则卷曲(34.14%)组成;将猪伪狂犬病毒TK基因与鸡、牛、猫科、马科、人类的胸苷激酶用DNASTAR 绘制进化树进行分析,可知猪疱疹病毒Ⅰ型TK基因亲缘关系与哺乳动物的疱疹病毒较近,而与禽类的相对较远.