水稻白叶枯病菌毒性基因的克隆和功能分析

 通过DNA重组,用载体质粒pBR322和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae Dye)毒性基因突变体XcoM3105带有转座子Tn5的毒性基因片段,构建了11.6kb的探针质粒pVIRl。用α-32P-dATP标记该探针,从构建在粘粒pSa747上的病菌野生型菌株JXO Ⅲ染色体基因文库中,通过菌落原位杂交和Southern杂交,筛选了8个毒性基因的克隆(pNAX3101~3108。将其中一个毒性基因克隆pNAX3103通过三亲交配接合法转移到XcoM3105中,接合频率为2.06×10^-7。功能互补分析表明,pNAX3103可以互补突变体XcoM3105,恢复致病性,同时也能互补其淀粉酶(Amy)活性表型,由原来的淀粉酶阳性恢复为阴性反应。因此可以认为,被克隆的毒性基因片段具有完整的致病功能,毒性基因与淀粉酶基因之间可能存在着某种负调控关系。     

中国猕猴桃细菌性花腐病菌的鉴定

 从福建、湖南和湖北猕猴桃病花上分离到能引起花腐病的32个细菌菌株,经细菌学和BiologGN测试板测定,可以看出中国的猕猴桃细菌性花腐病菌与新西兰的猕猴桃花腐病菌、丁香假单胞菌丁香致病变种Pseudomonas syringae pv.syringae和绿黄假单胞菌P.viridiflava相似,与萨氏假单胞菌P.savastanoi和猕猴桃溃疡病菌P.syringae pv.actinidiae有更多的不同,但是DNA/DNA同源性测定结果却显示出中国的菌株可分为2个类型:第1个类型与新西兰猕猴桃花腐病菌和萨氏假单胞菌有很高的同源性,第2类型与绿黄假单胞菌有很高的同源性,说明中国菌株分别属于这2个种。第1类型来自于福建和湖北,第2类型来自于湖南。     

转座子Tn5诱导的水稻白叶枯病菌毒性基因突变体及其生化行为

 通过接合试验,将转座子Tn5从三个供体菌中引入水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae Dye)日本系统小种3菌株(JXOⅢ)的细胞内,接合频率分别为0.2×10^-6,0.4×10^-7和0.27×10^-6。随机挑选的接合子总DNA与³²P标记的含有Tn5的探针质粒(pJB4JI:Tn5)杂交,放射自显影显示出同源杂交带。在6000个JXOⅢ的Tn5诱变株中,发现13个菌株对8个供试水稻品种(早生爱国3号,IR26,IR20,IR8,cas209,南粳15,金南风和TN-1)都不致病,表现为不亲和反应。在含有酶解基质的平板上,比较了JXOⅢ和13个毒性基因突变体的胞外水解酶活性和多糖产量。结果发现所有突变体的蛋白酶活性和胞外多糖产量都增强;所有突变体的淀粉酶活性和大多数突变体的果胶酶活性都是从无到有;突变体纤维素酶活性基本不变;大多数突变体的酯酶活性有所降低。     

大豆疫霉根腐病菌单游动孢子的毒性遗传与变异

 采用离体叶柄伤口接种法测定大豆疫霉根腐病菌44号生理小种单游动孢子连续3代或4代分离后代的毒性,结果表明:从S1中选择与亲本相比毒性不发生变异的1号单游动孢子菌株(44号生理小种)和变异最大的30号单游动孢子菌株(1号生理小种)继续分离2代或3代,单游动孢子毒性变异趋势主要是从44号生理小种变异为3号生理小种,也有变异成毒性公式为7或1a,7的单游动孢子。大豆疫霉根腐病菌无性世代毒性变异几率很高,多数单游动孢子毒性在分离后代中都发生变异,产生不同的小种或毒性公式,并且毒性变异基本不能稳定遗传。     

甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的快速检测与鉴定

 甘蓝枯萎病菌生理小种传统鉴定方法费时费力,不能满足生产的要求,因此需要建立一种快速、可靠的分子检测技术。本研究在甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种基因组测序的基础上,通过比较基因组学方法筛选1、2号生理小种各自的特异基因片段并设计引物,并分别以10个甘蓝枯萎病菌1号生理小种菌株、2个2号生理小种菌株、7个尖孢镰刀菌其他专化型菌株及4个外围菌株DNA为模板进行常规PCR扩增,筛选出甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种特异性引物,同时引入尖孢镰刀菌通用引物W106R/W106S,建立起一步三重PCR检测甘蓝枯萎病菌1、2号生理小种的分子检测技术。结果表明,该分子检测技术实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测出甘蓝枯萎病菌DNA、罹病甘蓝组织和土壤中的甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种,对检测甘蓝植株是否感染枯萎菌及甘蓝种植区土壤是否受到枯萎菌的污染有实用价值。     

玉米大斑病菌有性杂交F1代菌株的生理小种鉴定和AFLP分析

玉米大斑病菌是异宗配合真菌，有性杂交有可能增强病菌的致病力，或形成新的致病小种，因此对该病菌有性杂交后代进行致病性测定和遗传多态性分析对控制该病菌的危害具有重要意义。对亲本菌株132、135和它们杂交产生的70个单子囊孢子F1代菌株进行了生理小种鉴定和AFLP（扩增性片段长度多态性）分析。生理小种鉴定结果表明，F1代菌株中与亲本菌株132（23N号小种）属于同一小种类型的占41．4％，与亲本菌株135（23号小种）相同的占20．0％，另外还出现了0、1、2、3、13、123、12N、13N和123N号小种，所占比例分别为2．9％、1．4％、2．9％、2．9％、4．3％、8．6％、1．4％、4．3％和10．0％，说明有性杂交可使后代菌株的致病性发生比较广泛的变异。AFLP分析表明，F1代菌株之间分子遗传相似系数在0．87～0．99之间，其中84．3％的F1代菌株与亲本菌株的遗传相似系数在0．878以上，但与亲本菌株132同源性较强的F1代菌株数目大约是与亲本菌株135的5倍，说明不同菌株具有不同的遗传传递能力。比较生理小种鉴定和AFLP分析结果，发现生理小种分化和AFLP分子遗传多态性间有一定的相关性，但不能完全对应，不存在遗传谱系就等于小种的简单对应关系。     

福建稻瘟菌毒性类型组成及其对水稻几个Pi基因的毒性频率

 稻瘟病是福建省水稻生产中的重要病害之一,系统掌握稻瘟菌毒性类型组成和变化动态及其与主要抗病基因的互作特点,是制定抗病品种选育与合理利用的依据。本研究根据稻瘟病菌与6个CO39近等基因系品种互作亲和性的结果,将1995~2001年从福建采集分离的398个有效单孢菌株区分为26个毒性类型,其中毒性类型I34.1出现频率最高,为优势毒性类型,出现频率较高的还有I20.1、I04.1、I24.1、I0.1、I30.1等;结果还发现福建稻瘟菌群体对Pi1和Pi2毒性频率较低,分别为7.53%和11.31%,特别是对Pi1和Pi2基因联合毒性频率仅2.76%,说明在水稻抗瘟育种中可以考虑将Pi1和Pi2基因累加利用。     

小麦白粉病菌越夏,越冬和春季菌源毒性结构比较

 分析了1992年和1993年不同时期采集的小麦白粉病菌越夏、越冬和春季菌源共238个菌株的生理小种、毒性基因结构和对9个推广品种的毒力频率。结果表明三种菌源在生理小种和毒性基因组成及出现频率是相似的,对9个推广品种的毒力频率均较高。这样在白粉病菌毒性和品种抗病性研究中,可以采集应用越夏和越冬菌株标样,避免了夏季高温季节保存菌株的工作;而且从毒性结构方面进一步证实白粉病菌主要以分生孢子在夏季侵染高海拔地区的自生麦苗而越夏,再逐渐扩展至秋播麦苗越冬后导致春季大田发病,病菌的子囊孢子在平原地区侵染循环上作用不大。     

Rep-PCR技术对中国水稻条斑病菌的遗传多样性初析

 采用Rep-PCR技术,对30个水稻细菌性条斑病菌株(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)进行遗传多样性分析,同时对李氏禾条斑病菌等其它10个参试菌株也进行了比较。Rep-PCR是利用一些基于细菌的短的重复序列引物(ERIC和BOX)的DNA扩增特性,2种引物组合的电泳图谱结合并分析,以水稻细菌性条斑病菌各自的指纹谱型在相似率80%时可分为6簇,初步表明我国水稻细菌性条斑病菌群体的遗传分化明显;发现自然界存在的弱或无毒性菌株与毒性菌株的Rep-PCR指纹图谱差异很大;毒性菌株的遗传分簇与其致病性具有一定的相关性。用ERIC扩增水稻条斑病菌基因组DNA的指纹比BOX更为多样,两者对菌株的分辨率不同。因此,Rep-PCR技术可有效地用于监测水稻细菌性条斑病菌的遗传变异,还可应用于菌株的鉴定和分类学研究。     

水稻白叶枯病菌毒性基因调控hrp基因表达的分析

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)侵染寄主水稻,引起水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)。病原菌主要依赖hrp基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注入水稻细胞中,激发水稻的抗(感)病性。同源性搜索结果显示,植物病原黄单胞菌中已鉴定的一些毒性基因在Xoo的代表菌株PXO99A中保守存在。为了明确这些毒性基因对hrp基因表达调控的影响,本研究利用pK18mob-W介导的定点突变方法,成功获得了14个毒性基因的突变体;在突变体中,利用hrp∶∶gusA融合表达体系,通过GUS活性定量测定检测了hrpG、hrpX和hrpB1的启动子活性;通过荧光定量PCR技术,检测了这3个基因的mRNA水平。结果显示,双组分调控系统ColR/ColS、RpfC/RpfG和转录调控子Clp负调控hrpG和hrpB1的表达;Trh和Xrv A通过HrpG-HrpX途径正调控hrpB1的表达;HpaR1和Fur不依赖于HrpG仅通过HrpX正调控hrpB1的表达。这些调控关系的鉴定为解析水稻黄单胞菌hrp调控网络提供了新的线索。     

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)化学诱变hrp基因突变体及相关性状的研究

 硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)化学诱变水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)日本系统III号小种(JXOIII),获得16株hrp-突变体,其在感病寄主水稻IR26、汕优63上失去致病性和在非寄主烟草上失去过敏反应。所得的hrp-突变体并无黄色素缺失现象。16株hrp-突变体的淀粉酶、果胶酶、蛋白酶、纤维素酶和脂酶等胞外酶活性基本与野生型一致。JCM2092、JCM2211、JCM2252和JCM2457这4株hrp-突变体为III型泌出通道突变体,JCM0066等另12株hrp-突变体的超声波破碎液、离心上清液中无激发HR的信号物质存在。细胞组分分析表明,激发烟草HR的信号物质不是LPS而是蛋白类物质。来自JXOIII基因文库hrp基因克隆pUHRX245中的1.1kb SacI-KpnI片段,能够互补hrp-突变体JCM0066和JCM2482,使其恢复在烟草上激发HR的能力,但不能恢复其致病性。     

华南及菲律宾稻白叶枯病病原菌株致病性比较研究

 用国际鉴别寄主及中国鉴别寄主分别在华南及菲律宾两地,同时多次重复研究、比较、分析两地的稻白叶枯病病原菌株的致病力。用人工剪接法测定明确了中国及菲律宾的病情分级调查记载标准呈显著相关,均能反映华南与菲律宾的病情调查实际结果。对4个菲律宾和5个华南菌群而言,"金南风"及"脱脱普"全感,而"早生爱国3号"和"爪哇14号"则全抗。"黄玉"对华南菌群Ⅰ及Ⅱ抵抗,但对Ⅲ及Ⅳ群与4个菲律宾菌群则全感。"IR8"及"Cas209"对5个华南菌群全感,而"DV85"则全抗。"IR20"及"IR1545-339"抗华南菌群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ,但感染Ⅴ群。"TN1"及"金刚30"等品种全部感染华南及菲律宾菌群。"IR26"抗华南菌群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和菲律宾菌群Ⅰ,但感染华南菌群Ⅴ和菲律宾菌群Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。试验结果指出:华南菌群Ⅲ、Ⅳ的,致病力与菲律宾菌群Ⅰ相仿,而华南菌群Ⅴ则与菲律宾菌群Ⅳ相类似。此外,还研究比较分析了华南菌株与东南亚菲律宾、泰国和印度尼西亚诸国菌株间的致病力的异同情况。     

Involvement of Phosphoglucose Isomerase in Pathogenicity of Xanthomonas oryzae pv. oryzae

ABSTRACT Xanthomonas oryzae pv. oryzae, the causal agent of bacterial leaf blight of rice, was subjected to transposon mutagenesis to generate mutants defective in pathogenicity. A novel mutant 74M913 was attenuated in virulence but retained its ability to cause the hypersensitive response in leaf blight-resistant rice and tomato. Cloning and sequence analysis revealed that the transposon in 74M913 was inserted in a gene homologous to the phosphoglucose isomerase (pgi) gene of X. axonopodis pv. citri. Growth of the mutant in a synthetic medium containing fructose or xylose as a sole carbohydrate source was much reduced, indicating the transposon disrupted pgi function. The interaction between expression of pgi and hypersensitive response and pathogenicity (hrp) genes was investigated because we had demonstrated previously that expression of hrp genes of X. oryzae pv. oryzae is induced in a synthetic medium containing xylose. However, pgi and the hrp gene (hrcU) were expressed independently. This study suggests that PGI is involved in pathogenicity of X. oryzae pv. oryzae.     

Pathogenicity assays restrict the species Xanthomonas campestris into three pathovars and reveal nine races within X. campestris pv. campestris

The species Xanthomonas campestris (Vauterin) groups bacteria associated with cruciferous plants. In order to clarify and refine the pathovar and race structures within X . campestris , 47 representative strains of six pathovars were characterized for their pathogenicity on a large host range of Brassicaceae, including all original hosts. Three diseases were observed on tested plants: (i) black rot disease on cruciferous plants; it was proposed that all strains causing black rot on at least one cruciferous plant be grouped in the single pathovar X . c . pv. campestris ; (ii) leaf spot disease caused by X . c . pv. raphani on hosts belonging to the Brassicaceae and Solanaceae; the sequenced strain 756C identified as X . c . pv. armoraciae was included in this pathovar and the existence of another leaf spot disease caused by X . c . pv. armoraciae was not supported; and (iii) bacterial blight of garden stocks caused by X . c . pv. incanae . No plants susceptible to X . c . pv. barbareae were found. Strains that did not induce any symptom on cruciferous plants tested, including their original hosts, were removed from the pathovar scheme and were named X . campestris only. Three new races were described in addition to the six races previously described within X . c . pv. campestris . The sequenced strains ATCC 33913 (CFBP 5241) and Xcc 8004 (CFBP 6650) belonged to race 3 and to race 9 (one of the new races described), respectively.     

安徽省水稻品种对水稻白叶枯病的抗性及白叶枯病小种鉴定

为明确安徽省白叶枯病菌小种组成及常用、备用品种对该病的抗性,用白叶枯病强毒性小种FuJ和YN24、中等致病力的安徽省优势小种AH以及弱致病小种YN7对安徽省常用及备用水稻品种进行人工接种鉴定;用鉴别品种IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2、R24对安徽的白叶枯病菌株进行鉴定.结果表明,有3.5％的品种抗FuJ,15.4％的品种抗YN24,29.8％的品种抗AH;安徽省白叶枯病菌小种有R2、R5和R8,其中R5为优势小种.抗AH的品种可以用于安徽的水稻生产;生产中应防止FuJ和YN24等毒性强的菌株传入.     

云南水稻白叶枯病菌生理小种初析

从云南省 5个地州14个县市的水稻白叶枯病标本中分离水稻白叶枯病菌菌株 ,选择具有区域代表性的菌株 5 1株 ,利用已知抗病基因的近等基因系 ,在孕穗期应用剪叶法接种明确其生理小种。鉴定结果表明 ,云南省水稻白叶枯病菌小种复杂多样 ,共有 14种类型 ,暂定为YN1～YN14 ,优势生理小种为YN3、YN8、YN11,其中YN3分布在红河、德宏等 4个县市 ;YN8小种分布在大理等地区 ,小种的分布可能受地理区域的影响     

利用桥梁载体策略构建水稻条斑病菌T3SS基因诱导表达检测体系

 水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS)。Xoc主要依靠hrp基因簇(T3SS基因)编码的III型分泌系统(type III secretion system, T3SS)将效应蛋白注入水稻细胞中,激发寄主水稻的感(抗)病性。为了准确在Xoc中进行T3SS基因表达调控的分析,本研究设计出桥梁载体策略,将目标基因的启动子或者功能片段构建在高拷贝的桥梁载体,获得融合表达元件,通过亚克隆的方式将融合元件转入骨架载体上,获得用于转录表达和蛋白表达分析的载体。为了验证该策略的可行性,选取hrpG、hrpX和hrcC基因构建了相应的启动子探针载体和蛋白表达载体,将这些载体导入毒性调控子基因trh、lrpX和zur的突变体中,GUS活性测定、荧光定量PCR以及蛋白免疫杂交结果显示:在trh、lrpX和zur的突变体中,hrpG、hrpX和hrcC的转录表达水平、mRNA水平和蛋白表达水平呈现一致。这表明这套桥梁载体策略能够有效应用于T3SS基因转录表达和蛋白表达的分析。综上所述,运用桥梁载体能够克服低拷贝载体DNA遗传操作效率低的缺陷,这一策略也适用于毒性相关基因调控机理的研究,这将为Xoc-水稻互作研究提供高效的工作系统。     

豆科植物Xanthomonas属细菌的比较研究

 用菜豆、绿豆、爬豆、大豆、豇豆、黄槐和木豆等7种豆科植物上分离到的18个菌株作比较研究,它们分刷属于5个不同的种和变种,即Xanthomonas Pha-seoli、X.Phaseoli Var Sojense、X.Vignicola、X.Cassiae和X.Cahani。上述5种细菌的各个菌株,无论是形态和培养性状及生理反应都是相似的,只是对青霉素的敏感性和石蕊牛乳胨化的快慢稍有不同。凝集反应证明它们在血清学上也有密切的关系。Elrod和Braun认为X.Phaseoli Var Sojense和X.Vign-icola的血清反应与X.Phaseoli不同,应该归入不同的血清型。但是根据本项研究,发现这两种细菌的血清反应与X.Phaseoli没有差异,都可以归入Elrod和Braun所划分的X.Phaseoli血清型。不同种的细菌对相应噬菌体的反应是很专化的,因此噬菌体非但可以用来鉴别种,还能区别同一个种的不同菌系。但是噬菌体反应并不能作为划分种的性状。