植物病原黄单胞菌毒性相关基因对内源 过氧化氢的上游调控作用研究

 以植物病原细菌黄单胞菌的avrXa7基因和ahpC基因的2个突变体及其野生型菌株为研究对象,探讨植物病原细菌内源过氧化氢水平与菌株毒性的联系。AR/HRP法分析病原菌的过氧化氢清除力,组织化学法对细胞内过氧化氢进行定量和定位分析。结果表明,avrXa7基因的突变诱导病原菌毒性的显著降低,并引起病原菌内源过氧化氢积累水平显著下降;ahpC基因的突变诱导病原菌内源过氧化氢水平显著降低,但未能引起病原菌毒性产生显著的变化。研究结果说明,在植物病原细菌黄单胞病菌的致病机制中,病原菌内源过氧化氢的积累水平并不能直接决定菌株的毒性,而是处在avrXa7基因的下游,受到avrXa7或者更多毒性相关基因的调控,参与病原菌的致病过程。     

希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析

希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum)是一种重要的植物病原真菌,可引起严重的十字花科蔬菜炭疽病,对蔬菜生产造成了很大的影响。为了探究希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26在致病过程中的作用,本研究以希金斯炭疽菌侵染拟南芥Col-0后的cDNA为模板,通过qRT-PCR技术测定了ChAtg26基因在侵染过程中的表达模式,并利用同源重组技术构建了ChAtg26基因的敲除与回补突变体,分析了敲除ChAtg26基因对希金斯炭疽菌生长发育与致病能力的影响。结果表明,ChAtg26基因在病菌侵染寄主后0～40 h中有较高的表达量,而敲除ChAtg26基因后,病菌在生长速率、孢子萌发、附着胞形成以及对氧化胁迫敏感性方面没有明显变化,但是会在菌落黑色素累积与对细胞壁胁迫的敏感性方面有所下降,同时其产孢量与致病力会明显降低,说明ChAtg26基因参与了希金斯炭疽菌的黑色素合成、细胞壁胁迫应答反应、产孢与致病过程,并在这些过程中起着重要作用。     

十字花科黑腐病菌中一个假定蛋白基因XC_3605与致病相关

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是全球范围内能引起十字花科植物黑腐病的重要植物病原细菌,也是研究植物病原细菌与植物互作机制的模式细菌。利用自杀质粒pK18mobsacB诱变十字花科黑腐病菌Xcc 8004的XC_3605基因,获得缺失突变体D3605。表型分析发现D3605胞外多糖合成能力、游动能力及致病力显著降低,积聚形成生物被膜的能力增强。用带有全长XC_3605基因序列的pLAFRJ对D3605进行功能互补,其胞外多糖产量、游动性、致病力和生物被膜均得到恢复。研究结果表明,XC_3605基因在十字花科黑腐病菌致病过程中发挥作用。     

植物青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系统中hcp基因的克隆及其功能研究

Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)是新近报道的细菌蛋白分泌系统。基于植物青枯菌致病力分化菌株Po82的全基因组测序结果,发现其大质粒中存在T6SS的同源基因簇。本文通过基因敲除的方法构建了Po82菌株Ⅵ型分泌系统中的核心基因—hcp基因的缺失突变株,并比对了Po82野生型菌株、突变株及互补菌株在致病性、生长速率、运动性、生物膜形成等方面的变化。结果表明,hcp基因突变株较野生型菌株致病力显著减弱,病程延长;在生长速率、运动性及生物膜形成方面,突变株较野生型无明显差异。说明植物青枯菌Po82菌株T6SS中的hcp基因参与了细菌的致病过程。     

苹果树腐烂病菌Vm-milRNA9通过调控VmPEAMT的表达促进病菌侵染

植物病原真菌microRNA-like RNA(milRNA)通过调控靶标基因的表达广泛参与生长发育、逆境胁迫响应以及侵染致病等生命活动。前期在系统鉴定苹果树腐烂病菌(Valsa mali)milRNA的过程中,发现Vm-milR9在菌丝营养生长阶段高度表达,但在侵染过程中显著下调表达,降解组分析发现磷酸乙醇胺甲基转移酶基因VmPEAMT可能是其一个重要靶标基因。然而,Vm-milR9能否通过调控VmPEAMT的表达参与病菌致病仍不明确。为此,本研究首先创制了Vm-milR9的过表达菌株,发现其菌落生长速率和致病力均显著降低。进而分析了过表达菌株中候选靶标基因VmPEAMT的表达水平,发现Vm-milR9的过表达显著抑制了VmPEAMT的表达水平。同时利用烟草共转化技术证实了Vm-milR9在烟草细胞中能够特异性地抑制VmPEAMT的表达。在此基础上,创制了VmPEAMT的敲除突变体,发现突变体的菌落生长速率有一定程度降低,但致病力下降比例更为明显。上述结果表明Vm-milR9可以通过特异靶向抑制VmPEAMT的表达调控V.mali的营养生长和致病力。     

利用Gateway技术筛选Candidatus Liberibacter asiaticus致病相关基因研究

柑橘黄龙病是危害全球柑橘产业健康发展的最严重病害之一,病原为韧皮部限制性细菌,我国的柑橘黄龙病由亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CaLas)引起。由于该病原菌难以获得离体纯培养,从而限制了其致病分子机制的研究。本试验根据已经报道的植物病原细菌致病相关基因特点,从黄龙病菌亚洲种Psy62菌株全基因组序列(Psy62:NC_012985.1)中选取3个假定致病相关基因,分别标记为PalCa _(Las)、MotCa _(Las)和HlyCa _(Las),利用Gateway技术的同源重组原理,将3个基因通过BP反应和LR反应,分别构建到植物表达载体psk103中,接种本生烟(Nicotiana benthamiana)后,通过瞬时表达筛选可诱导_(N.)benthamiana产生过敏性坏死反应的功能基因。经过PCR克隆和测序验证,PalCa _(Las),、MotCa _(Las)和HlyCa _(Las)基因均成功构建至植物表达载体上。本生烟瞬时表达试验证实:当含有目的基因的根癌农杆菌菌悬液OD600值介于_(0.)6_(~0.)~(8,)测试本生烟苗龄6周左右,PalCa _(Las)基因在接种4 dpi时可引发明显的HR(hypersensitive reaction)反应,12 dpi时HR反应更为强烈。同等条件下MotCa _(Las)和HlyCa _(Las)均不能引发类似反应。由此证实,Gateway技术可成功用于筛选CaLas致病相关基因,PalCa _(Las)基因可能在CaLas致病过程中发挥重要作用。该报道为国内首次采用Gateway技术进行CaLas致病相关基因功能研究,为后续开展CaLas病原寄主互作分子机制研究奠定了基础。     

QTL作图在植物数量抗病性遗传研究中的应用

 本文综述了近年来在植物数量抗病性遗传研究方面的进展及发展动态。列举了利用DNA分子标记定位和估计植物数量抗性座位或基因(QRL)的18个实例,从中归纳总结了控制植物数量抗病性的QRL数目、类别、效应及其基因与基因和基因与环境、植株生育期、病菌生理小种(或致病类型)间的互作关系。展望了QTL作图对复杂的数量抗病性的标记辅助选育和数量抗性基因图位克隆的发展前景。     

群体感应淬灭——防治植物细菌病害的新策略

群体感应（quorum sensing,QS）是细菌的一种调控机制,指细菌通过感应特定信号分子的浓度来感知周围环境中自身或其它细菌的数量,并调整相关基因的表达以适应环境的变化。多种植物病原细菌利用QS系统调控致病因子的表达,因此,QS系统可以作为细菌病害防治的新靶点。对细菌QS调控机制的干扰和破坏称为群体感应淬灭（quorum quenching）。本文介绍了QS与植物病原细菌致病性的关系,以及近年来群体感应淬灭研究的新进展。     

蔗糖水解酶注释基因XC0805与野油菜黄单胞菌8004菌株的蔗糖利用及致病相关

 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是造成十字花科植物减产的重要病原菌,其通过水孔或伤口进入植物体内并在维管束中快速繁殖。光合产物(蔗糖)的运输主要依靠植物维管组织,同时蔗糖也是维管组织重要的能量来源。本研究利用生物信息学和遗传学等方法对Xcc中参与蔗糖利用的基因进行了分析,并研究了这些基因与其致病力的关系。Xcc 8004菌株中注释的参与蔗糖分解蛋白的编码基因有XC1002、XC1642、 XC1645和XC0805。 XC1002和XC1642的编码产物属于糖苷水解酶GH97蛋白超家族,而XC1645和XC0805的编码产物则属于GH13家族。突变分析发现除XC0805外,其他3个都不影响Xcc的蔗糖利用能力。接种实验表明,XC0805参与Xcc的侵染或在植物体内的生长,其他3个不参与致病过程。另外,Xcc 8004中预测参与蔗糖转运的基因(XC0806和XC0807)突变并不影响细菌的蔗糖利用和致病力,表明其可能存在其他的蔗糖转运通路。上述结果说明XC0805可能是Xcc 8004主要的蔗糖水解酶基因,且在致病中起重要作用。     

蔗糖水解酶注释基因XC0805与野油菜黄单胞菌8004菌株的蔗糖利用及致病相关

 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是造成十字花科植物减产的重要病原菌,其通过水孔或伤口进入植物体内并在维管束中快速繁殖。光合产物(蔗糖)的运输主要依靠植物维管组织,同时蔗糖也是维管组织重要的能量来源。本研究利用生物信息学和遗传学等方法对Xcc中参与蔗糖利用的基因进行了分析,并研究了这些基因与其致病力的关系。Xcc 8004菌株中注释的参与蔗糖分解蛋白的编码基因有XC1002、XC1642、 XC1645和XC0805。 XC1002和XC1642的编码产物属于糖苷水解酶GH97蛋白超家族,而XC1645和XC0805的编码产物则属于GH13家族。突变分析发现除XC0805外,其他3个都不影响Xcc的蔗糖利用能力。接种实验表明,XC0805参与Xcc的侵染或在植物体内的生长,其他3个不参与致病过程。另外,Xcc 8004中预测参与蔗糖转运的基因(XC0806和XC0807)突变并不影响细菌的蔗糖利用和致病力,表明其可能存在其他的蔗糖转运通路。上述结果说明XC0805可能是Xcc 8004主要的蔗糖水解酶基因,且在致病中起重要作用。     

植物小RNA在病毒致病过程中的作用研究进展

目前,我国正遭受多种外来有害生物的入侵,给我国的农业生产以及生态环境造成了严重影响。其中检疫性植物病毒危害大、隐蔽性强,是重要的外来生物。掌握病毒致病的相关机制是有效防控入侵病毒病害的基础。微小RNA(microRNA,miRNA)以及病毒小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)是植物体内重要的非编码小RNA,在病毒致病过程中扮演着重要角色。病毒在侵染过程中,可以利用植物抗病毒免疫反应产生的siRNA进行致病,同时可以直接或间接干扰miRNA的代谢途径,导致相关症状的产生。本文根据植物小RNA的近期研究进展,对miRNA和病毒siRNA的产生途径、生物学特性以及作用分子机制进行了综述,并对其在病毒侵染过程中的作用进行了探讨,初步从小RNA的角度阐述了植物病毒的致病机制,以期为检疫性病毒病害的防控提供理论基础。     

马铃薯晚疫病菌效应子PITG_16427.2的基因序列分析及功能验证

 马铃薯晚疫病的病原是致病疫霉菌(Phytophthora infestans),该病原菌在侵染马铃薯过程中分泌大量RxLR型效应子,但目前绝大多数RxLR效应子的功能和作用机制尚不明确。本研究成功克隆了致病疫霉菌的一个RxLR效应子PITG_16427.2,在本氏烟中瞬时表达PITG_16427.2,发现该效应子能够抑制6种激发子(INF1、PsojNIP、BAX、SIF2、Avh238、Avh241)激发的植物免疫反应。进一步研究发现,效应子PITG_16427.2在晚疫病菌侵染马铃薯早期上调表达。在15个致病疫霉菌株和3个同属菌株中克隆该基因,克隆到氨基酸序列一致性超过93%的同源基因,这些同源基因均能在本氏烟中抑制INF1和Avh241引起的HR,揭示了该效应子在病原卵菌中序列和功能的高度保守性。在本氏烟和马铃薯感病品种Désirée中瞬时表达PITG_16427.2,发现该效应子能够显著促进晚疫病菌的侵染。通过qRT-PCR方法检测发现,乙烯信号的相关基因ERF1显著上调,而水杨酸信号相关基因PR1b显著下调,表明PITG_16427.2在晚疫病菌侵染过程中可抑制寄主的SA信号途径,促进晚疫病菌侵染。因此,RxLR型效应子PITG_16427.2是致病疫霉菌中一个重要的侵染致病因子。     

苹果树腐烂病菌含cupin结构域蛋白Vmcupin1的鉴定及功能分析

由苹果黑腐皮壳(Valsa mali)侵染引起的苹果树腐烂病是严重威胁我国苹果产业健康发展的重大枝干病害。揭示病菌致病机理有助于制定病害防控新策略。含cupin结构域蛋白是一个大的蛋白家族，广泛参与植物发育和逆境胁迫响应等多种生命活动。有关植物病原真菌中该类蛋白的研究报道很少，其参与菌丝生长和侵染致病的生物学功能尚不明确。基于V.mali与苹果树皮互作的转录组分析，发现一个在病菌侵染过程中显著上调表达的基因。蛋白序列特征分析发现，该蛋白含有1个典型的cupin结构域，且与其他物种含cupin结构域蛋白高度同源，将之命名为Vmcupin1。实时荧光定量分析发现Vmcupin1在病菌侵染过程中显著上调表达。创制了Vmcupin1缺失突变体和回补菌株，发现该基因缺失后，病菌生长速率在一定程度上降低，其致病力和适应H₂O₂和NaCl胁迫的能力显著降低，表明Vmcupin1在病菌营养生长、侵染致病，以及逆境胁迫中发挥重要功能。研究结果丰富了真菌含cupin结构域蛋白功能的认知，有助于全面解析腐烂病菌致病机理。     

晚疫病抗性相关基因NbMybl的克隆与功能分析

Myb转录因子广泛参与调控植物生长发育以及应对环境胁迫,但有关其对晚疫病抗性调控机制的研究较少。本研究从本氏烟草中克隆获得一个含Myb-like结构域的蛋白编码基因,命名为NbMybl。该基因开放阅读框全长为753 bp,编码250 aa。实时荧光定量PCR(qPCR)结果显示NbMybl受致病疫霉(Phytophthora infestans)侵染诱导表达。亚细胞定位表明NbMybl定位在植物细胞核和细胞质中。利用病毒诱导的基因沉默技术,发现沉默NbMybl能够明显降低本氏烟草对致病疫霉的抗性。分析比较NbMybl沉默和非沉默对照烟草株系应对P.infestans侵染的转录组数据,发现差异表达基因(Differentially expressed genes, DEGs)8486个,其中上调基因4202个,下调基因4284个。使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库进行基因富集分析,发现鉴定得到的DEGs中共有373个参与植物-病原菌互作,308个参与植物激素信号转导,216个参与植物MAPK信号途径。推测这些DEGs可能与...     

猕猴桃溃疡病菌不致病菌株G230的鉴定及形成原因分析

为探索田间猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae(Psa)致病力丧失的分子机制,针对从猕猴桃果园中分离获得的1株不致病菌株G230,通过特异性引物检测和多基因序列分析明确其分类地位,并设计引物检测其是否由已知遗传变异引起,通过比较基因组学、基因表达、超敏反应和荧光素酶报告菌株检测确定引起菌株G230致病力丧失的原因。结果表明,不致病菌株G230为Psa生物型3(Psa3),其致病缺陷不是由已报道的遗传变异引起;基于基因组比较分析发现菌株G230中的hrpS基因被转座子ISPsy36插入破坏,导致Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,T3SS）不能正常表达;而在不致病菌株G230中表达hrpS基因后能恢复其T3SS功能,使其具备致病能力及激发非寄主超敏反应的能力。表明转座子ISPsy36插入hrpS基因内部可以破坏Psa的T3SS功能进而使其丧失致病力,这是自然条件下Psa3丧失致病力的一种新型机制。     

钙离子响应蛋白GCaMP6s在稻瘟菌中的异源表达

稻瘟病严重威胁全球水稻的产量,钙离子信号通路参与了稻瘟菌生长、发育和致病,了解这些过程中菌株细胞质中钙离子浓度的变化对稻瘟病的防治具有重要意义.GCaMP6s作为一种细胞质钙离子感受蛋白在动物和植物中已有大量应用.本研究利用不同稻瘟菌菌株构建了 GCaMP6s基因的异源表达菌株,在0.01 g/mL钙离子处理下,GCa...     

用基因芯片技术分析水稻白叶枯病菌侵染过程的基因表达图谱

水稻白叶枯病是由水稻黄单胞细菌(Xan- thomonas oryzae pv．oryzae,简称Xoo)侵染引起的。对Xoo致病机理的研究已从传统生物学、生理生化学逐渐向分子生物学以及新近发展起来的基因组学方向发展。已经从Xoo中克隆和定性了 vir、avr、hrp等几十个致病相关基因,对这些基因结构和功能的研究,在一定程度上增加了对Xoo 与水稻互作分子基础的认识。然而,病原菌致病过程是一个极其复杂的过程,病原菌需要侵入寄主, 避开寄主的防卫反应,摄取营养,形成有效定殖。这一过程不是一个或几个基因产物所能完成的,而是需要大量的毒性因子在特定的时间、空间进行特异水平的表达,才能实现成功的侵染。为了全面认清病菌的致病机理,仅仅对单个基因的功能进行研究显然是不够的,还需要从整个基因组水平上了解     

大丽轮枝菌JR2特异的乙醇脱氢酶的生物学功能研究

大丽轮枝菌是世界范围的植物病原真菌，能够侵染660多种植物，可造成严重的经济损失。大丽轮枝菌基因组分析发现不同菌株含有菌株特异基因，但是大部分基因的生物学功能还不清楚。本研究通过比较大丽轮枝菌VdLs17和JR2的基因组鉴定出1个JR2菌株特异性基因Chr6g02370,该基因编码乙醇脱氢酶，且在侵染过程中被诱导表达。敲除突变体的乙醇脱氢酶酶活性显著降低，但对乙醇等碳源的利用能力并未受到影响。敲除突变体对烟草和番茄的致病力显著降低。表型分析表明敲除该基因降低了黑色素合成能力，但不影响菌丝生长和产孢。研究结果丰富了人们对大丽轮枝菌菌株特异基因生物学功能的认识，为深入开展其功能基因组学研究提供了遗传材料。     

植物抗病基因工程研究进展（Ⅱ）：植物抗细菌基因工程

植物抗病基因工程研究进展（Ⅱ）──植物抗细菌基因工程华中农业大学植保系（４３００７０）王伍华中农业大学生科院（４３００７０）伍建宏２抗细菌植物基因工程２．１破坏细菌细胞壁该策略是将原校或真核生物的溶菌酶基因导入植物，通过植物细胞表达外源溶菌酶破坏细菌...     

草莓多主棒孢霉小柱孢酮脱水酶基因CcSCD1的功能研究

 多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)是世界范围内重要的植物病原真菌,其引起的草莓棒孢霉叶斑病对草莓产业的健康发展具有潜在威胁。小柱孢酮脱水酶(scytalone dehydratase,SCD)是真菌多聚二羟萘类(DHN)黑色素生物合成途径中的关键酶,在植物病原菌致病过程中发挥重要作用。本研究通过同源重组的方法获得了草莓多主棒孢霉小柱孢酮脱水酶基因(CcSCD1)的敲除突变体,并进行了回补和RT-PCR验证。与野生型相比,敲除突变体△CcSCD1-2表现为菌落无色素沉积、菌丝稀疏、产孢量显著下降、分生孢子无色较小以及致病力明显减弱。结果表明,CcSCD1参与调控多主棒孢霉的黑色素生物合成、营养生长、分生孢子产量及致病力。