苎麻UDPGDH原核表达载体的构建与表达

通过RT-PCR 获得UDPGDH cDNA序列,经酶切、连接,以pET-32a为原核表达载体,构建成pET-32a- UDPGDH 重组表达载体.经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化表达受体菌E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导后表达出1个约53 000的蛋白,与推测的UDPGDH编码产物的大小一致.凝胶成像分析表明,最高表达量可占菌体总蛋白的47.1%,表明UDPGDH 重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达.     

高山红景天GH3基因克隆及序列分析

参照已知植物GH3的氨基酸序列,通过比较找出相对保守的氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE法得到高山红景天GH3的3'端,其长度838bp,编码200个氨基酸的602 bp位于GH3的开放阅读框内和一段长36bp的3'非编码区(3'UTR).序列比较结果表明,GH3推导的氨基酸序列与已公布的几种植物GH3氨基酸序列有较高的序列同源性.     

采收前短期红膜遮阴处理对高山红景天根的生长及红景天苷产量的影响

[目的]为提高栽培高山红景天的经济价值,研究了采收前短期红膜遮阴处理对高山红景天根生物量、红景天苷含量及产量的影响。[方法]对高山红景天分别进行了10、20、30和40 d的红膜遮阴处理,测定了雌株和雄株高山红景天根中红景天苷的含量和产量。[结果]红膜遮阴处理显著提高了高山红景天根中红景天苷的含量和产量,并且无论是雌株还是雄株,高山红景天根中红景天苷的产量均表现为在红膜遮阴处理20 d时最高,增幅分别达到21.21%和32.91%。[结论]从生产实际出发,在收获前20 d对高山红景天进行遮红膜处理,有利于提高红景天苷的产量。     

犬IL-2基因克隆及原核表达

[目的]研究犬IL-2基因的克隆和表达,为开发新型免疫增强剂和基因工程疫苗提供理论支持。[方法]从犬全血中分离出白细胞,经刀豆素刺激培养20 h后,提取总RNA;根据GenBank中犬IL-2基因序列,设计1对引物,进行PCR扩增,并构建原核表达载体pET-28a,将其转化到宿主菌BL21中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析。[结果]RT-PCR扩增出一条约500 bp的条带,与预期结果相符;重组质粒pMD18-T-IL2经双酶切后,产生一个约500 bp基因片段,说明目的基因被成功克隆;表达载体pET-28a-IL2经双酶切和PCR鉴定后,分别产生一个约500 bp目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,分子量约为20 kDa,与预期蛋白大小基本相同。[结论]犬IL-2基因被成功克隆和表达。     

棉花GhRGL基因克隆及其原核表达研究

GA信号转导途径是通过DEUA蛋白来抑止的.通过对Genbank进行Blast比较,首次克隆了棉花DELLA蛋白基因,长度为1644bp,分离的棉花DELLA蛋白进行生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥中的DEUA蛋白一样的保守结构域,对克隆的基因进行原核表达研究,将克隆的基因转化原核表达载体pET22b,在E.coli BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhRGL蛋白,大小约为64kDa.首次实现了棉花DELLA蛋白基因在原核系统中的表达,为棉花DELLA蛋白的抗体制备及其表达定位研究奠定了基础.     

棉花UXS基因生物信息学分析与原核表达

通过生物信息学方法对已克隆的3个棉花UXS基因GhUXS1、Gh UXS2和GhUXS3编码产物进行亲疏水性,结构域以及功能等多方面预测,同时将产物连接至pET-32a(+)原核表达载体,并转化BL21(DE3)plys菌株,在IPTG诱导下,利用Western blotting方法检测GhUXS1、GhUXS2和Gh...     

辣椒上CMV亚组ⅠB CP基因克隆与原核表达

[目的]克隆辣椒上黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)基因,诱导CP蛋白表达,为下一步制备高效、特异的抗血清奠定基础.[方法]根据已知的新疆石河子辣椒上的CP基因序列设计引物,克隆CMV CP基因,经测序、Noc Ⅰ/BamH Ⅰ酶切鉴定,成功构建了原核表达载体pET-CMV CP,转化大肠杆菌BL21 DE3,用终浓度为1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测目的蛋白表达.[结果]成功构建了新疆辣椒上CMV CP原核表达载体pET-CMV CP,获得了与预期大小一致的30 kDa蛋白.[结论]新疆石河子辣椒上CMV CP在原核中获得了正确表达.     

基质金属蛋白酶-7的基因克隆和原核表达

研究构建人基质金属蛋白酶7(MMP-7)的原核表达载体,并进行原核表达获得重组蛋白MMP-7。以人肾肿瘤组织总RNA为模板,PCR方法获得MMP-7成熟蛋白的基因序列,构建含10xhis标签的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得重组蛋白,并经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),检测其表达情况。最终得到pET24a(+)-MMP-7-10his重组质粒,诱导表达后重组蛋白占总蛋白的41%左右,获得21.2kD大小蛋白,与目的蛋白大小一致,纯度大于90%,为进一步研究奠定基础。     

羊口疮病毒B2L基因克隆及表达

为了获得羊口疮病毒囊膜蛋白。以羊口疮病毒基因组为模板,利用羊口疮病毒B2L基因特异性引物,进行PCR扩增,回收以及纯化PCR产物,连接到PMD18-T载体上,测序结果表明B2L基因全长1 137 bp,编码379个氨基酸。再将B2L基因克隆至p ET-30a,构建原核表达载体p ET30a-B2L。经菌液PCR、酶切鉴定以及SDS-PAGE等方法表明成功构建原核表达载体,这将为今后的单抗制备以及羊口疮病毒的疫苗研究打下基础。     

猪UGT 1A1酶基因的克隆、表达及其对呕吐毒素特异性降解的作用

为了在Sf9昆虫细胞中表达猪尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT) 1A1蛋白并对其进行功能鉴定。首先,合成密码子优化的UGT 1A1基因,克隆到载体pFastBacⅠ中,构建杆状病毒重组转移载体,然后导入DH10Bac中,获得重组的穿梭质粒,再转染Sf9细胞得到重组杆状病毒,采用Western blotting方法鉴定重组后UGT 1A1蛋白的表达;对镍柱亲和层析纯化获得目的蛋白酶的动力学参数及其对呕吐毒素(DON)的代谢进行检测。结果表明：pFastBac-UGT 1A1质粒被成功构建,导入感受态细胞DH10Bac中获得重组穿梭质粒Bacmid-UGT 1A1,再转染昆虫细胞Sf9获得重组Bacmid-UGT 1A1蛋白,能够与多组氨酸标签单抗发生特异性反应。优化目的蛋白表达,并对其体外代谢DON进行了酶学性质和动力学参数的研究。本研究通过基因克隆、表达和代谢产物的分析等技术手段获得具有较好的生物活性且纯化的Bacmid-UGT 1A1蛋白,为揭示DON在肝脏中的代谢途径、代谢产物和关键调控因子提供参考。     

利用CODEHOP方法克隆高山红景天葡萄糖基转移酶基因cDNA片段

根据已报道的植物糖基转移酶氨基酸序列,利用CODEHOP方法设计简并引物,同时利用改良的CTAB法提取高山红景天的叶片RNA并反转录为cDNA第1链,然后采用3-′RACE的方法克隆得到未知糖基转移酶的3′端基因序列(GenBank登录号EU145020),并采用生物信息学技术进行序列分析。结果证明CODE-HOP引物设计结合茉莉酮酸甲酯诱导方法克隆获得未知糖基转移酶基因成功率更高。     

高山红景天种子特性研究

[目的]调查分析高山红景天种子的特性。[方法]以长白山野生高山红景天和和龙栽培高山红景天的种子为试材,按大小将其分成3类并对其形态、大小以及发芽特性进行研究。[结果]高山红景天种子为香蕉形,种皮呈淡棕色或深棕色,表面有多个条状突起,且多为纵向,种子两侧有较粗的棱。高山红景天种子大小的差异较为明显,大种子的平均长度为1.650~1.855 mm,平均宽度为0.433~0.488 mm,中等种子的平均长度为1.385~1.438 mm,平均宽度为0.435~0.447 mm,小种子的平均长度为1.120~1.390 mm,平均宽度为0.386~0.435 mm;高山红景天种子在152、02、5和30℃4个温度下的发芽率不同,在15℃下发芽率最低,30℃下发芽率最高,且发芽率从低温到高温呈逐渐升高的趋势。[结论]为利用有性繁殖技术大规模栽培高山红景天提供了基础理论依据。     

库页红景天多糖的抗氧化作用评价

【目的】探讨库页红景天多糖的体外抗氧化作用,为红景天多糖的合理开发利用提供科学依据。【方法】采用黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶—鲁米诺发光体系、抗坏血酸-CuSO4-酵母-H2O2系统及荧光法分别测定库页红景天多糖对超氧阴离子（O2）、羟自由基（·OH）、NO的清除作用,同时采用Fe2＋诱发脂蛋白过不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化体系评价库页红景天多糖的抗脂质过氧化作用。【结果】库页红景天多糖的总糖含量为42.49%,糖醛酸含量为38.28%。库页红景天多糖能有效清除O2、·OH、NO及抑制脂质过氧化,抑制率分别达到90.50%、87.72%、70.25%和85.05%,其对应的IC50分别为3.30 μg/mL、0.90 mg/mL、20.00 μg/mL和0.90 mg/mL。【结论】库页红景天多糖是一种良好的天然抗氧化剂,可应用于食品、医疗和保健等方面。     

高山红景天花粉形态观察

利用扫描电镜对高山红景天花粉进行了观察,结果表明:来自长白山与大兴安岭的高山红景天花粉的外形、大小较为接近,花粉表面纹饰均呈不规则排列,且纹饰间存在较大的间隙,但无孔隙;两种来源的高山红景天花粉表面纹饰的分叉与交叉的程度则存在较大的差异,来自长白山的花粉表面纹饰分叉与交叉情况比来自大兴安岭的花粉更为复杂,这些花粉表面微观形态的差异将为高山红景天种质资源来源的鉴定提供依据。     

高山红景天生殖生态学——有性生殖与无性生殖的调查

通过原产地调查、栽培试验、分根扦插及种子萌发实验等，研究了高山红景天的繁殖及扩散方式。结果表明：高山红景天有两条生殖途径，一条是有性生殖，另一条是无性生殖。在原产地生境条件恶劣的情况下，有性生殖能力弱，主要靠无性生殖来产生大量后代，保存物种；而在太平沟人工移栽条件下，两种生殖方式都能正常进行。     

高山红景天花器的解剖结构研究

以栽培高山红景天花为材料,采用石蜡切片技术观察了不同性别高山红景天花器的解剖结构,结果表明:不同性别高山红景天花器的解剖结构有所不同,且雌花和两性花的子房内均有数目不等的胚珠发育,而雄花子房内无胚珠发育.     

高山红景天叶片愈伤组织诱导与植株再生

以高山红景天叶片作为外植体,研究了影响愈伤组织诱导、芽增殖、生根的主要因素。结果表明:高山红景天叶片切块诱导愈伤组织的最佳培养基为MS 6-BA 2mg/L NAA0.5mg/L,诱导率达88.33%;高山红景天叶片切块经诱导可产生3种色泽的愈伤组织,其中只有绿色愈伤组织诱芽容易,绿色愈伤组织在附加1mg/L6-BA 0.1mg/LNAA的MS培养基中有利于芽的分化和增殖,培养7周左右,平均每个外植体分化形成的再生小植株数达到21.33个;增殖苗转入1/2MS培养基中生根率高达100%。     

高山红景天愈伤组织的玻璃化法保存及植株再生

采用玻璃化法对高山红景天的愈伤组织进行了超低温保存研究.高山红景天愈伤组织在8%蔗糖中暗培养5 d后,先用25℃的60%玻璃化保护剂PVS2预处理20 min,转至100% PVS2于-20℃乙醇浴中处理2 h后,投入液氮进行保存,48 h后使用40℃水浴快速化冻.冻存后的愈伤组织用液体培养基MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+40%蔗糖洗涤3次,再转入MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.5 mg/L固体培养基中在22℃条件下进行暗培养,2周后转入光照培养（光照强度800 lx）. 6周后观察到高山红景天愈伤组织呈鲜绿色,长势较为旺盛,存活率可达到78.24%.冻存后的愈伤组织可诱导成苗.      

高山红景天不同器官氨基酸含量的分析

[目的]为更好地利用高山红景天提供科学依据。[方法]测定了高山红景天不同器官的氨基酸含量。[结果]高山红景天地上部分和地下部分的氨基酸含量和组成不同,地上部分的氨基酸含量高于地下部分,人体必需氨基酸的含量以叶片中最多,为55.75～87.21mg/g;其次是茎,为36.13～37.39mg/g;根中最少,仅13.17～14.30mg/g。半必需氨基酸以根中最多,叶次之,茎中最少。不同器官的氨基酸含量因发育时期而变化,茎、叶中的氨基酸含量从营养生长期到果熟期呈由高变低的趋势,根中的氨基酸含量变化不大。[结论]高山红景天不同器官中的氨基酸含量与组成不同。     

红景天根腐病菌生物学特性

红景天根腐病菌(Fisarium oxysporum Schlecht)菌丝生长适宜温度为20～30％，适宜pH值为5；分生孢子萌发适宜温度为25～35℃，适宜pH值为5，在不同营养液里以红景天汁、牛肉膏、酵母汁、葡萄糖等的营养液中萌发良好。对碳源的利用以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖为最佳；氮源以蛋白胨、酵母液、牛肉膏最佳；在不同培养基里以PDA最佳。测定了不同时间下菌丝和分生孢子的致死温度。结果分别为70℃10min和60℃10min。