基于序列功能注释的蛋白质相互作用预测方法研究

蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)是大多数细胞过程和生物功能的基础.该研究基于蛋白质功能注释方法(FNM)首次提出了结合蛋白的重要性的方法、结构域相互作用、基因本体论注释序列和注释;然后融合不同的策略,分别建立了3种方法结合的蛋白质序列特征与FNM功能注释功能.利用蛋白质相互作用预测构建蛋白质相互作用网络是进一步理解蛋白质功能的必要前提,也是理解细胞新陈代谢及复杂疾病形成发生的基础和关键.     

水稻ARAB-1类似基因的电子克隆及生物信息学分析

[目的]对水稻OsARAB-1基因进行电子克隆,并对其进行生物信息学分析.[方法]以NP 174188.1为查询探针,通过电子克隆获得OsARAB-1基因全长cDNA,用生物信息学软件对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析.[结果]获得了OsARAB-1基因全长cDNA,基因编码区序列(CDS)全长1 086 bp.电子定位于第五染色体基因组序列NC 008398.2核苷酸序列6 769 813 ～6 773 213 bp区域.OsARAB-1蛋白属于亲水性的胞外蛋白,比较稳定,偏碱性.二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主.具有2个功能结构域:SGNH水解酶型酯酶、GDSL脂肪酶.有21个磷酸化位点、7个糖基化位点.推定的活性位点的氨基酸残基为Ser34、Gly107、Asn167、Asp333、His336.与玉米酯酶亚型B4FM12亲缘关系最近.OsARAB-1基因的表达对水稻的发育和形态发生起重要作用,与水稻抗稻瘟病有关.[结论]该研究为用试验方法克隆该基因和功能鉴定奠定了基础.     

基于蛋白质相互作用网络的茶树抗假眼小绿叶蝉研究

[目的]细胞生长的每个阶段都离不开蛋白质相互作用,研究假眼小绿叶蝉侵染茶叶后差异基因参与的蛋白质相互作用对解析抗虫分子机理具有指导意义.[方法]对有无受假眼小绿叶蝉侵害的都匀毛尖茶树鸟王种进行转录组测序,基于同源比对算法构建0h与12h、0h与24h的差异基因蛋白质相互作用网络.[结果]0h与12 h的差异基因共有21...     

利用 GST pull-down 联合质谱技术鉴定H7N9 禽流感病毒 PA-X 的互作蛋白

[目的]为探究H7N9亚型禽流感病毒(AIV)PA-X蛋白的功能,采用GST pull-down联合质谱技术筛选与鉴定与PA-X相互作用的宿主蛋白.[方法]构建PA-X的重组表达载体pGEX-4T-PA-X,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,并利用GST亲合树脂进行纯化得到GST-PA-X融合蛋白.利用GST pull-down技术,将GST-PA-X和GST对照蛋白分别与A549细胞裂解液总蛋白进行体外孵育,得到的蛋白复合物经SDS-PAGE分离后进行质谱检测分析.[结果]经GST pull-down筛选与质谱分析鉴定后得到39个高可信度的可能与PA-X互作的候选蛋白质.通过GO注释和KEGG等通路富集分析发现,这些蛋白主要参与RNA的代谢及加工、mRNA翻译及运输、多肽生物合成及基因表达的转录后调节等生物学过程.对其中评分最高的蛋白Hsp70-2与PA-X的相互作用作进一步验证,免疫荧光试验结果表明Hsp70-2与PA-X可以在细胞浆中共定位.[结论]利用GST pull-down联合质谱技术筛选到39种与PA-X互作的候选蛋白,且经免疫荧光试验证明候选蛋白Hsp70-2与PA-X存在共定位,为深入探讨PA-X在AIV生命周期中的作用机制奠定基础.     

观赏海棠'火焰'果皮中可变剪接基因分析

[目的]研究观赏海棠'火焰'果皮中可变剪接基因.[方法]利用已有苹果属观赏海棠品种'火焰'果皮转录组测序数据,分析可变剪接类型和数量,并对发生可变剪接的基因进行KEGG分析,研究观赏海棠可变剪接基因与其发育过程的关系.[结果]在观赏海棠果皮发育过程中,主要发生的可变剪接是第一个外显子可变剪接和最后一个外显子可变剪接两种类型.可变剪接在果皮发育前期发生较多,同时KEGG通路分析表明可变剪接主要发生在嘌呤代谢、氧化磷酸化、糖酵解/糖异生等通路过程中.[结论]可变剪接在观赏海棠果皮的整个发育过程中普遍存在.观赏海棠果皮发育过程中共有的可变剪接基因主要与磷酸化和糖代谢有关.     

椰子乙酰CoA羧化酶(ACC)基因的鉴定及表达分析

[目的]克隆椰子的乙酰Co A羧化酶(ACC)基因.[方法]通过已发表的椰子转录组注释结果,鉴定潜在的椰子ACC基因.分析ACC基因在椰子果肉和嫩叶混合样转录组中的RPKM值,同时,采用实时定量PCR技术研究5个高RPKM值的ACC基因在椰子果肉发育的不同时期的表达情况.[结果]共获得21个椰子的ACC基因,这21个ACC基因在椰子果肉和嫩叶混合样品中有较高的表达量,4个ACC基因(Unigene7806、Unigene47155、Unigene7847和CL185.Contig1)在椰子果肉发育9个月时表达量最高.[结论]该研究为解析椰子脂肪酸积累的分子机制提供了前期工作基础.     

蛋白激酶C的克隆和生物信息学分析

[目的]PKC在信号转导、气孔调节、细胞分化中具有重要作用.该研究目的是为了克隆蛋白激酶C并预测它的性质.[方法]从玉米B73中克隆得到zmPKC(玉米蛋白激酶C)的cDNA,并目.通过生物信息学的方法预测了它的特性,包括保守结构域、理化性质、特殊磷酸化位点和N端糖基化位点等.[结果]证明zmPKC长1 269 bp,编码422个氨基酸,有一个外显子和俩个内含子及一个蛋白激酶域,2个N端糖基化位点和28个特殊磷酸化位点,等电点为4.98,分子量为132 074.70.[结论]zmPKC的克隆和生物信息学分析能利于进一步研究PKC的功能.     

扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白(PICK1)基因的克隆及序列分析

[目的]分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Monieziaexpansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因蛋白激酶C相互作用蛋白,全长1 527 bp,编码447个氨基酸,CDS预测存在明显的BAR,PDZ结构域.编码蛋白的理论分子质量为50.173 3 ku,等电点为5.22.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础.     

化脓链球菌磷酸化蛋白组的分析

化脓链球菌是一种革兰氏阳性致病菌,严重威胁人类及家禽健康。运用溶液酶解的方法将化脓链球菌中的全蛋白消化成肽段,利用TiO_2富集化脓链球菌中的磷酸化肽段和Finnigan Surveyor HPLC系统串联LTQ-Orbitrap质谱对富集的磷酸化肽段进行分析。鉴定到167个磷酸化肽段,对应57个磷酸化蛋白。生物信息学分析显示这些蛋白主要涉及到细胞生物合成、细胞有机物及其衍生物代谢、信号传递、基因转录、生物应激等生理过程。通过STRING软件对这57个磷酸化蛋白进行相互作用网络分析,发现7个磷酸化蛋白相互作用网络。化脓链球菌的磷酸化蛋白组为深入解析化脓链球菌的毒力、耐药的发生发展机制提供理论基础,为开发新的抗菌药物提供新视角。     

化脓链球菌磷酸化蛋白组的分析

化脓链球菌是一种革兰氏阳性致病菌,严重威胁人类及家禽健康。运用溶液酶解的方法将化脓链球菌中的全蛋白消化成肽段,利用TiO_2富集化脓链球菌中的磷酸化肽段和Finnigan Surveyor HPLC系统串联LTQ-Orbitrap质谱对富集的磷酸化肽段进行分析。鉴定到167个磷酸化肽段,对应57个磷酸化蛋白。生物信息学分析显示这些蛋白主要涉及到细胞生物合成、细胞有机物及其衍生物代谢、信号传递、基因转录、生物应激等生理过程。通过STRING软件对这57个磷酸化蛋白进行相互作用网络分析,发现7个磷酸化蛋白相互作用网络。化脓链球菌的磷酸化蛋白组为深入解析化脓链球菌的毒力、耐药的发生发展机制提供理论基础,为开发新的抗菌药物提供新视角。     

玉蕈原生质体制备条件研究

[目的]探索了玉蕈原生质体的制备与再生的适宜条件。[方法]采用斜面、平板培养基和液体培养基,研究了玉蕈菌丝体酶解时间(1~5 h)、酶解温度(25℃)和菌龄(4~7 d)以及渗稳剂种类(甘露醇、蔗糖、KCl、MgSO4)对玉蕈原生质体制备与再生的影响,优化了玉蕈原生质体制备与再生的条件。[结果]玉蕈原生质体制备与再生的适宜条件是:渗稳剂为0.6 mol/L MgSO4.7H2O,玉蕈菌丝体酶解时间2h,酶解温度25℃,菌龄5 d。在此条件下,玉蕈原生质体的产量最高,达16.7×106个/ml。[结论]该研究为利用原生质体技术进行玉蕈育种奠定了基础。     

响应面法优化泰妙菌素生产菌株原生质体再生培养基

[目的]采用响应面法对泰妙菌素生产菌株原生质体的再生培养基进行优化。[方法]利用Minitab统计软件,采用中心复合响应面设计对泰妙菌素生产菌株原生质体再生培养基的琼脂浓度和蔗糖浓度进行了优化。[结果]泰妙菌素生产菌株原生质体的再生培养基优化为马铃薯20.00%(浸提液)+葡萄糖2.00%+蔗糖2.70%+琼脂1.56%,p H=6.5。优化后的再生培养基的单菌落复苏率由0.7‰提高到3.5‰。[结论]该研究可为泰妙菌素的研发奠定基础。     

红酵母原生质体制备和再生条件研究

［目的］初步探讨红酵母原生质体制备和再生的条件。［方法］以红酵母为试材,研究渗透压稳定剂pH值、酶浓度、酶解时间、预处理时间4个因素对红酵母原生质体制备率和再生率的影响。［结果］pH值在6.5～7.0,原生质体的制备率和再生率随着渗透压稳定剂pH值的升高而上升。当酶浓度从0.2%上升到1.0%时,原生质体制备率上升较快,而原生质体再生率下降较慢。随着酶解时间的增加,原生质体的制备率逐渐增加,而原生质体的再生率逐渐下降。在5～15 min,原生质体制备率和再生率均随着预处理的时间的增加而降低。［结论］当渗透压稳定剂pH值为7.0,蜗牛酶酶浓度为1.0%,酶解时间为60 min,预处理时间为5 min时,原生质体的制备率和再生率能分别达到较高的值。     

药用植物青天葵叶片原生质体的制备与纯化

[目的]研究青天葵原生质体的制备与纯化方法。[方法]以青天葵新鲜叶片为试验材料,以青天葵叶片原生质体产量及原生质体存活率为考察指标,研究了预处理、酶解方式、酶解温度、离心转速、光照、筛网目数等因素对青天葵原生质体分离纯化效果的影响。[结果]适宜青天葵叶片原生质体游离的条件是用浓度13%甘露醇溶液预处理叶片1 h、酶解温度（25±1）℃、黑暗、静置;原生质体纯化采用离心沉淀法,以200目筛网过滤后离心8 min（800 r/min）,操作2次,可得到大量完整清晰、细胞碎片少的原生质体。[结论]该方法获得了制备青天葵原生质体的理想条件与参数,为建立青天葵原生质体再生体系提供了依据。     

拮抗木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件优化

[目的]优化拮抗木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件,快速、高效获得绿色荧光标记菌株,为哈茨木霉及同类真菌的GFP标记提供参考,并为下一步研究其在不同环境中的定殖动态、分布规律及生防特性等打下基础.[方法]采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,从木霉菌株的菌龄、酶解时间、转化体系中质粒的含量及再生培养基中潮霉素B(HmB)的浓度等方面对哈茨木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件进行优化,获得表达稳定的转化子,并与出发菌株的生长特性进行比较,评价转化效果.[结果]gz-2菌株培养36 h菌丝所形成的原生质体稳定性最好,菌丝体酶解3.5 h获得的原生质体数量最多,达11.67×106个/mL;每240μL转化体系中质粒DNA含量为40μL,得到的转化子数量最多,为8.67个/皿;再生培养基中HmB含量为600μg/mL时可获得稳定的强转化子.[结论]筛选获得1株表达稳定的转化子GFP-gz-2菌株,该菌株在菌落形态、菌丝生长速率及产孢量上与出发菌株gz-2无显著差异,且具有较好的遗传稳定性.     

烟管菌T1原生质体制备及菌丝再生条件优化

[目的]研究烟管菌T1(Bjerkandera adusta)原生质体制备及菌丝再生的最佳条件。[方法]研究菌龄、渗透压稳定剂种类和浓度、pH、酶浓度及酶解时间对原生质体得率的影响,并研究再生培养基种类对菌丝再生的影响。[结果]在PDA液体培养基中,以28℃摇床培养3 d的菌丝最适于该菌原生质体制备;用0.5 mol/L KCl配制的含有15 mg/m L的溶壁酶于30℃下酶解3 h,获得原产量最高,达1.18×10~6个/m L;RM1培养基再生率最高,达1.22%。[结论]该研究优化了原生质体制备及菌丝再生条件,为进一步研究烟管菌噬藻分子机制提供理论依据。     

灵芝原生质体的高效制备及诱变

[目的]探讨灵芝原生质体的高效制备及诱变方法。[方法]用2.5%溶壁酶、0.5%蜗牛酶和0.5%纤维素酶组成的复合酶液裂解适龄灵芝菌丝体,制备原生质体,统计其再生频率,并用制备出的原生质体进行诱变试验。[结果]采用该制备方法获得了高质量的原生质体,其再生率能稳定达到80%以上,且经复合诱变后发生基因突变的频率也较高。[结论]该研究为后续的灵芝诱变选育奠定了基础。     

金耳原生质体制备与再生研究

[目的]对金耳原生质体制备与再生体系进行研究。[方法]采用正交试验法筛选金耳原生质体制备和再生体系中酶体系、菌龄、温度、时间、渗稳剂的最佳用法。[结果]金耳原生质体的释放方式有3种类型:酶解初期的顶端释放、侧位释放和后期的原位释放。其最佳制备条件为:液体静置培养3 d的菌丝体,在1%纤维素酶+1%蜗牛酶+1%溶壁酶的混合酶液中,以0.6 mol/L蔗糖为渗稳剂,36℃酶解4 h,得到原生质体制备率达1.76×107个/ml;最佳再生条件为:液体静置培养5 d的菌丝体,在1.5%溶壁酶的酶液中,以0.6mol/L蔗糖为渗稳剂,33℃酶解3 h,得到原生质体再生率达0.22%。[结论]为金耳的原生质体融合、紫外线诱变育种、基因工程研究等提供了有益支持。     

金耳原生质体制备与再生研究(英文)

[目的]对金耳原生质体制备与再生体系进行研究。[方法]采用正交试验法筛选金耳原生质体制备和再生体系中酶体系、菌龄、温度、时间、渗稳剂的最佳用法。[结果]金耳原生质体的释放方式有三种类型:酶解初期的顶端释放、侧位释放和后期的原位释放。其最佳制备条件为:液体静置培养3d的菌丝体,在1%纤维素酶+1%蜗牛酶+1%溶壁酶的混合酶液中,以0.6mol/L蔗糖为渗稳剂,36℃酶解4h,得到原生质体制备率达1.76×107个/ml;最佳再生条件为:液体静置培养5d的菌丝体,在1.5%溶壁酶的酶液中,以0.6mol/L蔗糖为渗稳剂,33℃酶解3h,得到原生质体再生率达0.22%。[结论]为金耳的原生质体融合、紫外线诱变育种、基因工程研究等提供了有益支持。     

芦荟原生质体的分离

[目的]为进一步的离体培养快速繁殖奠定基础,同时也为原生质体的融合(体细胞杂交)提供条件。[方法]采用酶解的方法以芦荟的叶片为材料进行原生质体分离。[结果]用芦荟的叶肉细胞可成功分离出原生质体,而且活力较高,可达90%以上。[结论]芦荟原生质体的成功分离主要取决于材料的来源、酶液的组成。另外还受酶解液的渗透压、温度和pH值影响。