LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞炎症损伤模型的建立

采用LPS诱导子宫内膜上皮细胞炎症模型,通过研究细胞因子IL-1β、TNF-αmRNA的表达验证模型,为进一步对子宫内膜炎发病机理的研究和治疗药物疗效的评价奠定基础。经组织块原代培养和胰酶纯化分离得到奶牛子宫内膜上皮细胞,并通过免疫组化鉴定细胞纯度。采用0、10、30、50、100μg/mL的LPS分别在3、6、9、12、18 h刺激纯化后的子宫内膜上皮细胞,采用MTT法筛选出最佳刺激浓度时间为30μg/mL,12 h,然后以最佳刺激浓度刺激子宫内膜上皮细胞,在12 h后收集细胞,最后通过荧光定量RT-PCR检测IL-1β、TNF-αmRNA的表达差异性。     

LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的建立

[目的]采用脂多糖(LPS)作为刺激源,建立奶牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)氧化损伤模型.[方法]体外培养BEEC并进行细胞鉴定,用不同浓度的LPS刺激细胞,在不同时间点用CCK-8法测定细胞存活率,以确定BEEC氧化损伤模型条件.倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测细胞中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT).[结果]与空白对照组相比,当LPS浓度为80μg/mL,作用时间为12 h时,造成细胞损伤,其细胞凋亡率、ROS产生量和MDA含量明显高于对照组,SOD和CAT活性显著低于对照组.[结论]建立奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的条件为LPS作用浓度80 μg/mL,作用时间12 h.     

苦参碱对奶牛子宫内膜上皮细胞抗炎作用及其机制

为探究苦参碱在抗炎方面的作用,本试验用LPS建立奶牛子宫内膜上皮细胞炎症损伤模型,通过MTT法测得LPS最佳刺激浓度为30μg/mL,作用12h;苦参碱的低中高浓度分别为5、10、20μg/mL。RT-PCR分别检测3、6、12h各组细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)mRNA的表达变化,结果表明,苦参碱显著(P0.05)降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表达,具有较强的抗炎作用。     

鼠李糖乳杆菌 GR-1 介导 MAPK 信号通路抗大肠杆菌 诱导奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤

为探讨鼠李糖乳杆菌GR-1(Lactobacillus rhamnosus GR-1)防治奶牛子宫内膜炎的具体通路机制。本研究利用L. rhamnosus GR-1和大肠杆菌（Escherichia coli）处理原代培养的奶牛子宫内膜上皮细胞（Bovine endometrial epithelial cells,BEECs）,设对照组、E. coli攻毒组、L. rhamnosus GR-1单独处理组、L. rhamnosus GR-1预处理再加入E. coli组,然后利用细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡情况;采用Western blot技术检测p38、JNK、ERK蛋白磷酸化水平;利用MAPK特异性信号通路抑制剂抑制目的信号转导;通过Realtime qPCR技术检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)mRNA的表达水平。结果显示,与E. coli攻毒组相比,L. rhamnosus GR-1预处理组的奶牛子宫内膜上皮细胞的凋亡数量显著降低（P<0.05）,且p-p38、p-JNK蛋白表达水平极显著...     

槲皮素通过TLR4/MyD88途径改善LPS诱导的bEECs的炎症反应

【目的】旨在探明槲皮素对LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞(bEECs)炎症反应的作用。【方法】用组织块和差时消化法分离纯化bEECs, 1μg/mL脂多糖(LPS)作用12 h后,添加不同浓度槲皮素(10, 20, 40μM)孵育12 h,采用Western blot法检测TLR4和MyD88蛋白的表达,同时通过qRT-PCR法检测炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的相对表达量。【结果】经CK18免疫荧光染色证实获得的bEECs纯度较高。LPS作用后,细胞炎症因子的表达显著高于对照组(P<0.01)。相比于LPS组,槲皮素孵育后,可降低炎症因子和TLR4/MyD88的表达(P<0.01)。【结论】槲皮素可通过抑制TLR4/MyD88的表达,改善LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞的炎症反应,该结果将为奶牛子宫内膜炎的治疗提供了新的研究思路和理论依据。     

鼠李糖乳杆菌GR-1介导TRIF/NF-κB信号通路抗大肠杆菌诱导奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤

为探讨鼠李糖乳杆菌GR-1(Lactobacillus rhamnosus GR-1,L. rhamnosus GR-1)对大肠杆菌（Escherichia coli）诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞（Bovineendometrialepithelialcells,BEECs）炎性损伤的保护作用及其机制,本研究建立BEECs细胞炎性损伤模型,利用Real-time qPCR和Western blot技术,观察在BAY11-7082或siRNA干预前后,L. rhamnosus GR-1对E. coli触发的信号通路及炎性因子表达的影响。结果显示,L.rhamnosusGR-1可以显著抑制由E.coli引起的NF-κB和TRIF通路的激活及炎性因子的表达,在BAY11-7082干预后,E. coli诱导的NF-κB通路的激活及炎性因子的表达得到了显著的抑制。同样,在添加TRIF siRNA后,E. coli诱导的TRIF mRNA及炎性因子的表达水平也显著下降,产生和L. rhamnosus GR-1一致的抗炎效果。本研究表明L. rhamnosus GR-1可通过介导NF-κB和TRIF通...     

小鼠子宫内膜上皮细胞体外培养方法比较

为探讨适用于小鼠子宫内膜上皮细胞的培养方法,对胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶消化+刮取法、Ⅰ型胶原酶消化法、Ⅰ型胶原酶消化法+刮取法、子宫翻转组织块培养法5种方法进行了比较研究.结果表明,胰蛋白酶消化法获得的上皮细胞数量稀少,活力低,生长速度缓慢;刮取法+胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、刮取法+Ⅰ型胶原酶消化法获得的细胞数量较单纯胰蛋白酶消化法多,但达不到研究所需的要求;子宫翻转组织块培养法获得的上皮细胞活力强,生长速度快,纯度高,比较适宜小鼠子宫内膜上皮细胞的原代培养.     

DIRAS3诱导猪子宫内膜上皮细胞自噬及对容受性相关基因表达的影响

【目的】旨在探究DIRAS3对猪子宫内膜上皮细胞自噬的调控作用，并分析其对子宫内膜上皮细胞增殖凋亡及子宫内膜容受性相关基因表达的影响，为揭示DIRAS3在猪胚胎附植过程中发挥的功能提供科学依据。【方法】通过构建DIRAS3基因慢病毒载体感染猪子宫内膜上皮细胞，利用Realtime PCR方法检测自噬标志基因LC3-Ⅱ和P62、自噬调节因子mTOR及子宫内膜容受性相关基因COX2、HOXA10、LIF和MSX1的表达水平，并利用CCK-8与流式细胞法分别检测细胞增殖、细胞凋亡情况。【结果】在猪子宫内膜上皮细胞中，DIRAS3可上调LC3-Ⅱ的表达，下调P62的表达，诱导自噬的发生。同时，转染慢病毒干扰载体至子宫内膜上皮细胞发现，DIRAS3表达的抑制，可明显促进细胞中mTOR表达，并诱导细胞增殖，降低细胞凋亡率，且可极显著提高COX2、HOXA10和LIF的表达水平，降低MSX1的表达水平，而此过程中添加雷帕霉素（mTOR抑制剂）处理阻断mTOR通路后，子宫内膜上皮细胞中自噬水平无明显变化，且DIRAS3调控细胞增殖凋亡和容受性相关基因表达的能力受到抑制。【结论】DIRAS3可能通过参与...     

虾青素对脂多糖(LPS)诱导奶牛子宫内膜细胞凋亡的影响

子宫内膜炎是奶牛养殖业常见的一种繁殖疾病,目前主要利用抗生素进行治疗.本试验利用已成功构建的子宫内膜细胞炎症模型,研究添加1μmol/L虾青素对脂多糖(LPS)诱导奶牛子宫内膜细胞调亡的影响,处理24 h后利用流式细胞仪检测细胞的凋亡比例,利用荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测Bax、Bcl-2、F...     

外泌体miR-218抑制脂多糖诱发子宫内膜上皮细胞免疫因子释放研究

[目的]探究奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体及其miR-218在减轻大肠杆菌脂多糖诱发免疫反应中的作用.[方法]用不同质量浓度大肠杆菌脂多糖作用于奶牛子宫内膜上皮细胞系24 h后采用细胞计数试剂盒检测细胞活性;酶联免疫吸附测定检测免疫因子IL-1β和TNF-α释放;采用透射电子显微镜和蛋白印记法验证提取外泌体的粒径和标识蛋白CD63表达,荧光定量聚合酶链式反应法检测外泌体中miR-218表达变化;采用激光共聚焦显微镜观察外泌体与奶牛子宫内膜上皮细胞融合;细胞转染mimics 218检测其对大肠杆菌脂多糖诱发奶牛子宫内膜上皮细胞免疫因子释放的影响.[结果]100μg/mL大肠杆菌脂多糖处理奶牛子宫内膜上皮细胞后,IL-1β、TNF-α含量均显著高于对照组(P＜0.05);大肠杆菌脂多糖刺激奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体中miR-218的表达量极显著低于奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体中miR-218的表达量(P＜0.01);正常培养奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体能够与大肠杆菌脂多糖处理的奶牛子宫内膜上皮细胞融合并与NF-KB (p65)蛋白共定位于细胞质中.将奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体加入到100 μg/mL大肠杆菌脂多糖处理奶牛子宫内膜上皮细胞24 h后,显著抑制了大肠杆菌脂多糖引起的奶牛子宫内膜上皮细胞培养上清中的IL-1β和TNF-a释放(P＜0.05).同样的,转染进奶牛子宫内膜上皮细胞内mimics 218与磷酸化的NF-KB (p65)核外部分共定位并显著抑制了大肠杆菌脂多糖诱发的奶牛子宫内膜上皮细胞中TNF-α释放(P＜0.05),而对IL-1β释放无显著差异.[结论]miR-218能够随着健康子宫内膜上皮细胞分泌外泌体进入到受到大肠杆菌脂多糖刺激奶牛子宫内膜上皮细胞内,并与磷酸化p65核外部分共定位并抑制大肠杆菌脂多糖引起的TNFα的释放.     

FLCN对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳功能的影响

FLCN基因参与多种代谢途径和细胞过程,国内外关于FLCN在奶牛乳腺发育过程中表达及调节的研究鲜有报道。应用RNA干扰技术和质粒转染技术改变FLCN基因在奶牛乳腺上皮细胞中表达量,流式细胞仪检测细胞增殖,采用qRT-PCR和Western blot检测FLCN对泌乳相关功能基因AMPK、mTOR、CyclinD1、Caspase3和β-酪蛋白表达的影响。结果表明,FLCN正向调节mTOR磷酸化水平,促进乳蛋白合成和细胞增殖,抑制细胞凋亡,负调控能量代谢调节子AMPK。FLCN在奶牛乳腺上皮细胞中可通过mTOR信号通路调控细胞增殖及乳蛋白合成,研究对揭示FLCN调控奶牛乳腺上皮细胞增殖和泌乳具有重要作用。     

奶牛瘤胃上皮细胞分离培养与鉴定

在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传至第5代,β-半乳糖苷酶被染成蓝色,同时,细胞出现衰老和停滞生长;5)染色体核型分析表明奶牛瘤胃上皮细胞的染色体数为60条。研究发现通过酶消化奶牛瘤胃组织能够获得奶牛瘤胃上皮细胞,但只能传至5代。     

茶多酚对氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤的保护作用

用过氧化氢(H2O2)建立体外奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激损伤模型,研究不同质量浓度茶多酚对氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤的影响。MTT法检测细胞存活率,比色法检测细胞培养液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,分光光度法检测天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的活性。结果显示:与H2O2损伤模型组相比,20～100μg.mL-1茶多酚处理组的奶牛乳腺上皮细胞存活率、SOD活性显著升高,而MDA含量、LDH与Caspase-3相对活性与细胞凋亡率均下降,其中以100μg.mL-1茶多酚处理组效果最显著,说明一定质量浓度的茶多酚可以缓解氧化应激所致的奶牛乳腺上皮细胞的损伤,提高细胞存活率,抑制乳腺细胞凋亡。结论:茶多酚对乳腺上皮细胞氧化应激损伤具有保护作用,其保护作用可能与降低MDA含量,增强SOD活性及抑制Caspase-3活性有关。     

纸色谱分离-紫外分光光度法测定当归中阿魏酸含量

直接用紫外分光光度法测定当归提取液中阿魏酸含量时,由于杂质干扰较大,影响测定精度,而采用纸层析分离可以将杂质除去。研究对纸层析的展开系统、不同萃取溶剂的稳定性等因素进行比较分析后,建立了纸层析分离-紫外分光光度法测定当归中阿魏酸含量的方法。纸层析分离条件为:以氯仿、甲醇、水和冰醋酸按体积比2∶2∶6∶0.5配比作为展开剂,检测波长为330nm,加样回收率为99.61%,标准差为2.79%,吸光度在0.020～0.061时线性关系良好。     

乳脂合成前体对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞蛋白质组学影响

向奶牛乳腺上皮细胞中添加β-羟基丁酸钠,利用双向电泳技术进行细胞亚细胞蛋白质组学方面的研究。结果表明,β-羟基丁酸钠对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞蛋白表达有显著影响。Imagemaster6.0软件分析出4个表达上调的蛋白点,鉴定分别是ENO1、α-glucosidase、plastin3和ARPC2。通过实时荧光PCR检测以上蛋白在mRNA水平的表达差异,结果均有不同程度的提高,其中以ENO1、α-glucosidase及Arpc2提高显著(P<0.05)。研究所筛选出的蛋白,将有助于进一步揭示奶牛乳腺上皮细胞增殖和泌乳机制。     

外源阿魏酸对水培地黄生长的影响

水培条件下,研究添加不同质量浓度的外源阿魏酸对地黄生长的影响,来模拟阿魏酸在大田的化感作用,以研究化感物质阿魏酸造成地黄连作障碍的机制.结果表明,与对照相比,质量浓度为2 mg·L-1阿魏酸处理对地黄生长影响不大;质量浓度为5和8 mg·L-1阿魏酸处理对地黄根长、根重、鲜重和株高都有较强的抑制作用;质量浓度为5 mg·L-1阿魏酸处理的地黄叶子和地黄根及质量浓度为8 mg·L-1阿魏酸处理的地黄叶子SOD和POD活性先升高,然后下降;地黄叶片和根中丙二醛含量持续升高;叶绿素含量下降,除质量浓度为2 mg·L-1阿魏酸处理外差异性显著.而质量浓度为8 mg·L-1阿魏酸处理的地黄根SOD和POD活性降至最低,丙二醛含量最低,根腐烂死亡.     

苦参碱对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及抗氧化能力的影响

【目的】探究苦参碱对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖、凋亡及抗氧化能力的影响。【方法】利用含0(A组),25(B组),50(C组),75(D组)和100μg/mL(E组)苦参碱的培养基培养奶牛乳腺上皮细胞。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测BMECs活性,采用流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测苦参碱对BMECs凋亡的影响,并检测苦参碱对BMECs抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的影响,采用real-time PCR对BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因的相对表达量进行检测。【结果】用药5d时,低质量浓度(25和50μg/mL)苦参碱对BMECs增殖具有促进作用,高质量浓度(75和100μg/mL)苦参碱对细胞增殖具有抑制作用;B~E组BMECs的凋亡率均极显著高于A组(P0.01);B~E组BMECs培养上清液中NO和乳酸脱氢酶(LDH)水平明显高于A组。B~E组BMECs的过氧化氢酶(CAT)活性均比A组高,其中C组极显著高于A组(P0.01);B~E组的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均极显著高于A组(P0.01),E组的超氧化物歧化酶(SOD)水平极显著高于A组(P0.01),各组MDA含量无显著性差异。与A组相比,苦参碱上调了B~E组BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因的相对表达量。【结论】低质量浓度苦参碱能够促进BMECs增殖,高质量浓度苦参碱则会抑制BMECs增殖;不同质量浓度苦参碱均可提高BMECs的抗氧化能力,其中50μg/mL苦参碱提高BMECs抗氧化能力的效果最明显。