云南边境O型口蹄疫监测及病毒VP1基因序列分析

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的主要侵袭偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病。口蹄疫病毒为微RNA病毒科口蹄疫病毒属成员,存在7个不同血清型,病毒VP1蛋白抗原性差异是病毒血清型划分依据,而其编码基因(1D)核苷酸序列差异是同型病毒拓扑型(Topotype)或基因型鉴别依据。采用O/A/C/Asia-1多重RT-PCR技术,对2006年自云南边境地区采集的120份动物组织样品,进行口蹄疫病原监测,检出O型口蹄疫病毒阳性样品15份。对阳性样品中病毒VP1基因全序列进行扩增、纯化后,克隆至pMD18-T载体测序,并与已知代表性毒株进行比对及系统发育分析。结果发现:云南边境O型口蹄疫病毒阳性样品VP1基因核苷酸序列同源性介于77.3%~98.7%,可划分为3个不同的拓扑型或基因型:中东-南亚型(ME-SA)或泛亚型(PAN-Asia)、古典中国型(Cathay)、东南亚型(SEA)。部分样品VP1蛋白表位43位、154位关键性氨基酸位点存在变异。     

口蹄疫病毒RT-PCR检测与血清型鉴别

针对编码非结构蛋白的3D基因合成一对引物进行口蹄疫病毒RT-PCR扩增,不同血清型病毒的RNA样本均显现一条457bp的目的带,与预期设计的长度相符合。在敏感性试验中,O型、A型和AsiaⅠ型病毒的最小RNA检出量分别为0.8ng、8ng和8ng。根据GenBank发表的口蹄疫病毒VP1和2A基因序列,采用多重RT-PCR鉴别口蹄疫病毒血清型,O型、A型和AsiaⅠ型病毒的特异性扩增片段分别为200bp、340bp和500bp。对9份乳鼠感染病料进行检测,确诊为O血清型口蹄疫病毒感染。     

云南边境Asia 1型口蹄疫监测及病毒vp1基因序列比较

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的主要侵袭偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病。口蹄疫病毒存在7个不同血清型,病毒VP1蛋白抗原性差异是病毒血清型划分依据,而其编码基因核苷酸序列差异是同型病毒Topotype型或基因型划分依据。采用RT-PCR及O／A／C／Asia1多重RT-PCR技术,对2006年期间自云南边境地区采集境外流动动物组织样品120份,进行口蹄疫病原监测,检出Asia1型口蹄疫病毒阳性样品7份。对阳性样品中病毒vp1基因全序列进行扩增、纯化后,克隆至pMD18-T载体测序,并与已知代表性毒株进行比对及系统发育分析。结果发现：云南边境Aisa1型口蹄疫病毒阳性样品vp1基因核苷酸序列同源性介于83．4％～99．5％,不同分离毒株以15％序列差异作为分型标准,存在1个新拓朴型或基因型V,且与已知的4个拓朴型或基因型不同。系统发育分析确定了1个新的遗传谱系Ⅶ。部分VP1蛋白表位关键性氨基酸位点存在变异。     

猪捷申病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析

应用PK细胞,从临床症状上表现为腹泻的仔猪肠内容物中分离到一株病毒,对该病毒进行RT-PCR检测,证明该病毒为猪捷申病毒(PTV),命名为PTVJS2013。对该病毒进行细胞半数感染量(TCID50)测定,动物试验以及VP1蛋白基因序列测定,并与国内外16株不同血清型PTV的VP1基因序列进行了同源性比较及系统进化树分析。结果表明,猪捷申病毒JS2013 VP1基因核苷酸与8型血清型PTV同源性达到99.6%。而与其他血清型的PTV VP1基因核苷酸的同源性仅在58.3%~74.7%之间;与国内分离的PTV-Jilin/2003/2(JN710381/PTV-8)和PTV-Fuyu/2009(HQ020378/PTV-8)亲缘关系最近,同属于PTV-8血清型一个分支。     

猪口蹄疫的防控

<正>猪口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的急性传染病,以口腔黏膜、蹄部、鼻端、母猪乳房出现水疱为特征,传播速度极快。一、病原口蹄疫的病原体是口蹄疫病毒,已知口蹄疫病毒有七种血清型,即O型、A型、C型、亚洲1型、南非1型、南非2型、南非3型。每种血清型还有若干个亚型,我国猪口蹄疫主要以O型为主。不同血清型所表现的临床症状基本一致,但交互免疫原性不强。该病毒对外界环境抵抗力很强,寒冷天气,口蹄疫病毒在外界环境存     

2株O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP1的核苷酸序列分析

口蹄疫(Food and mouth disease,FMD)是由小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物传染病,人也易感,对畜牧业危害极大。病原的变异性高,存在7种血清型(O,A,C,ASI-A1,SAT1-3)和多种亚型,群内各型同源性达60%~70%,但两群之间     

鸭肝炎病毒分子流行病学分析

为了解我国鸭病毒性肝炎(DH)的流行情况,本研究用标准DH病毒(DHV)Ⅰ型(DHV-1)抗血清和新型DHV(N-DHV)抗血清对国内分离的7株DHV进行了血清中和试验。结果表明,PLK株和YB3株为DHV-1;YB1、YB2、YB5、HY2和HY3株为N-DHV。同时,对国内分离的9株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列分析的结果表明,3株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,6株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%～77%。参照同属微RNA病毒的人肠病毒的血清型分型标准,通过对DHV VP1基因序列同源性比较,判定9株病毒的血清型。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。同型不同毒株间VP1基因的差异可以导致病毒在致病力、细胞感染能力等方面的差异。研究结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种独立的血清型,但尚未见血清亚型的流行。     

三种试剂盒检测猪口蹄疫O型抗体的对比试验

使用三种猪口蹄疫O型抗体检测试剂盒分别检测接种猪口蹄疫O型合成肽疫苗和猪口蹄疫O型灭活疫苗的免疫抗体,以探讨三种抗体检测试剂盒的相关性。结果发现,猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体ELISA试剂盒和猪口蹄疫O型液相阻断ELISA试剂盒都可检测猪口蹄疫O型合成肽疫苗,两种试剂盒的相关性达90.8%,而间接血凝试剂盒不能用来检测猪口蹄疫O型合成肽疫苗;猪口蹄疫O型液相阻断ELISA试剂盒和间接血凝试剂盒可用来检测猪口蹄疫O型灭活疫苗,两种试剂盒的相关性达93.7%,而猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体ELISA试剂盒不能用来检测猪口蹄疫O型灭活疫苗。     

浅谈口蹄疫疫苗的免疫与应用

引发口蹄疫的病毒属小RNA病毒科口蹄疫病毒属口蹄疫病毒,病毒粒子直径为20 nm~25 nm,近似圆形,呈二十面体,无囊膜。病原血清主要分A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia 1型。各血清型没有交叉免疫性,同血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫性。目前国内流行的病毒以O、A、和亚洲I型这三个血清型为主。口蹄疫的预防以免疫接种为首要措施,接种时应考虑疫苗株与流行株意愿同源性,同时还应考虑母源抗体水平等因素的影响。     

O型、A型及Asia-1型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据口蹄疫病毒VP1基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计4条特异性引物,通过对退火温度等反应条件进行优化,建立能够同时扩增出O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒的多重RT-PCR检测方法。结果表明,建立的方法最低可以检测出约含1 pg/μL的病毒样品;该方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等其他相关病毒的检测结果均为阴性,特异性良好。建立的方法能够对口蹄疫O型、A型、Asia-1型病毒准确定型,可广泛用于口蹄疫病毒3个血清型的快速检测和分子流行病学调查。     

O型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

为建立动物血清中O型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,通过获得的O型口蹄疫病毒VP1融合蛋白与相关单克隆抗体,制备了O型口蹄疫病毒抗体竞争化学发光检测试剂盒。结果表明:该方法能够定量检测猪、牛、羊血清中的O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体,与其他偶蹄类动物病原无交叉反应,具有良好的重复性;对该方法的特异性指标、敏感性指标进行了验证,同国产O型口蹄疫抗体检测试剂盒进行了比较,阳性样品符合率92.62%,阴性样品符合率92.14%,总符合率92.45%;重复性试验组内与组间变异系数分别低于10%和15%。综上,该研究建立的O型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法特异性高、敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。     

鸭肝炎病毒的分离与鉴定

1999-2008年从山东、河南、浙江、江苏、广西、山西、江西、广东、福建和辽宁等地有典型鸭病毒性肝炎症状的病死雏鸭中共分离得到22株病毒。用鸭肝炎病毒（DHV）Ⅰ型（DHV-1）抗血清和新型DHV （N-DHV）抗血清对分离的22株病毒进行血清中和试验;对22株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,然后对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列进行分析。结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种血清型。其中分离到的12株为DHV-1,10株为N-DHV。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。12株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,10株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%-77%。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。     

为什么许多猪场都不赢利

引发口蹄疫的病毒属小RNA病毒科口蹄疫病毒属口蹄疫病毒,病毒粒子直径为20 nm~25 nm,近似圆形,呈二十面体,无囊膜。病原血清主要分A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia 1型。各血清型没有交叉免疫性,同血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫性。目前国内流行的病毒以O、A、和亚洲I型这三个血清型为主。口蹄疫的预防以免疫接种为首要措施,接种时应考虑疫苗株与流行株意愿同源性,同时还应考虑母源抗体水平等因素的影响。     

O型口蹄疫病毒不同宿主适应毒株P1和3A基因的差异分析

为了明确O型口蹄疫病毒不同宿主适应毒株P1和3A基因位点的差异性,研究其遗传变异趋势,找出不同宿主适应毒株在P1和3A基因水平上位点的变异情况,将O型口蹄疫病毒O/XJ/10-11株分别接种于牛、乳鼠、猪及BHK-21细胞,获得相应的宿主适应毒株,提取RNA,反转录并扩增P1和3A基因,目的片段产物经琼脂糖凝胶电泳回收,并将其克隆到pMD19-T载体上,筛选阳性菌落,测序并分析其基因序列。结果表明:牛、乳鼠、猪、BHK-21细胞四种宿主适应毒株,核苷酸和氨基酸序列均未发生缺失,主要抗原位点稳定;P1基因发生了部分变异,变异程度依次为VP1、VP2VP3VP4,VP4基因最为保守;3A基因较稳定,变异较少;不同宿主适应毒株的变异程度依次如下:猪适应毒株BHK-21细胞适应毒株牛适应毒株鼠适应毒株。O型口蹄疫病毒在不同宿主传代过程中造成VP1基因的变异,但主要抗原位点稳定;VP2基因的变异均位于抗原表位上;鼠适应毒株作为口蹄疫原始毒种的保存更为有利。     

3株O型FMDV VP1基因的克隆与序列分析

以3株国内分离的O型口蹄疫病毒(FMDV)(分别命名F1、F2、F3)为研究目标,根据GenBank中注册的FMDV VP1基因的序列设计2对引物,采用RT-PCR方法成功地扩增出含有VP1全基因的cD-NA片段,将3个cDNA片段分别克隆到pMD20-T Vector载体中进行序列测定,得到3个毒株VP1基因的序列。结果表明,3个O型FMDV毒株VP1基因cDNA长度均为639 bp,编码213个氨基酸。3株O型毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在92.3%~94.2%之间,推导氨基酸序列同源性在97.2%~98.6%之间。与3个毒株同源性高的主要为香港和台湾的毒株。     

以多层磷酸钙纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒VP1和VP2基因重组疫苗的构建

构建以多层纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒基因重组疫苗。在GenBank中查询编码O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1 141-160氨基酸和VP2 1-33氨基酸的核苷酸序列,合成该两段基因的重组基因并命名为VP1-VP2基因。再通过PCR扩增VP1和VP2基因,并将VP1、VP2及VP1-VP2基因分别插入到真核表达载体pcDNA3.1中,构建3种重组真核表达质粒(pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP1-VP2),并分别对重组质粒进行酶切、PCR鉴定及测序分析。将构建的重组质粒制备成多层磷酸钙纳米颗粒,检测其粒径、稳定性及体外转染效率。重组质粒酶切结果显示,基因片段大小与预期相符;测序显示与GenBank中相应基因序列同源性为100%。制备的多层纳米颗粒粒径约为530nm;在4℃过夜保存后,溶液均匀透明;体外转染HEK293细胞的转染效率在9.6%左右。成功构建了以多层磷酸钙纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒VP1和VP2基因重组质粒,为进一步研究该基因疫苗奠定了基础。     

口蹄疫诊断技术的研究进展

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,该病传播速度快,宿主范围广,发病率高,主要侵害猪、牛、羊等70多种家畜和野生动物,人对其也敏感,给养殖业造成巨大的经济损失,世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。口蹄疫病毒基因组为单股正链RNA,约有8 500个核苷酸,病毒衣壳由4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)组成,其中VP1和VP3是主要免疫性抗原。口蹄疫病毒具有7个血清型,即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和AsiaⅠ,每个血清型又     

不同试剂盒检测猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫抗体的对比试验

使用口蹄疫O型正向间接血凝抗体试剂盒(IHA)和2个厂家生产的猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒(VP1-ELISA)分别检测接种猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后不同时间的抗体合格率,以探讨3种抗体检测试剂盒的相关性。结果显示,IHA试剂盒与两种VP1-ELISA的符合率较差,分别为11.7%、12.5%,I HA试剂盒不能用于检测合成肽疫苗免疫抗体;VP1-ELISA试剂盒可以科学评价合成肽疫苗免疫抗体,两种VP1-ELISA试剂盒的平均符合率为93.6%,但是VP1-ELISA(UBI)试剂盒的稳定性高于VP1-ELISA(Z)试剂盒。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒灭活疫苗毒株不同宿主系传代中VP1基因的遗传变异研究

口蹄疫病毒结构蛋白VP1参与构成病毒粒子的主要中和抗原位点,是4种结构蛋白中最易发生变异的。在病毒传代过程中,对VP1基因进行遗传变异分析是口蹄疫疫苗研制中不可或缺的环节。为此,作者扩增了经不同宿主系（乳鼠、BHK₂₁细胞）连传不同代次的AsiaⅠ型毒株的VP1基因,并对其进行遗传变异分析,毒株间核苷酸同源性为99.4%~99.8%,推导氨基酸序列同源性为98.6%~100%;制苗毒株经过不同宿主系有限传代后,与传代前的原毒(MF1)相比,VP1基因未发生大的变异,主要抗原位点较稳定,说明以此种方式获得的制苗毒株制备的灭活疫苗是稳定的,适用于该毒株流行区域内相关家畜的免疫预防。     

猪口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法的建立

根据猪口蹄疫O型流行毒株VP1序列设计出5条合成肽,以固相法合成并以此合成肽作为包被抗原建立猪口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法,并对该方法敏感性、特异性、重复性等进行验证。结果表明:该检测方法敏感性为96.0%,特异性为99.1%,批内与批间重复试验变异系数小于10.0%。比对试验结果显示,该检测方法与UBI猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒符合率为93.2%,与中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒符合率为85.7%。该猪口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法敏感性好、特异性强、稳定性高、操作简便,可用于检测O型口蹄疫抗体水平。