黄瓜绿斑驳花叶病毒抗血清制备及应用

用葫芦[Lagenaria siceraria（Molina）Stand．]作为黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）的繁殖寄主,通过差速离心和PEG二次沉淀法进行病毒提纯,用提纯病毒液免疫新西兰兔制备CGMMV抗血清。制备的CGMMV抗血清经间接ELISA法测定效价为1：5120;利用制备的抗血清检测田间样品,证明其可以用于CGMMV的血清学及免疫捕获RT—PCR检测。研究结果对今后开展葫芦科作物CGMMV检测,及时发现疫情以便采取防控措施,避免病毒扩散为害,确保葫芦科作物的安全生产具有重要意义。     

香石竹斑驳病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

 香石竹斑驳病毒（Carnation mottle virus,CarMV）是侵染香石竹的主要病毒。本研究从已鉴定的CarMV毒源植物中提取总RNA, 克隆外壳蛋白（cp）基因后构建pET30a CP重组质粒,并转入BL21（DE3）pLysS进行原核表达。通过对诱导温度、初菌浓度、IPTG的浓度等表达条件进行优化,目的蛋白在37℃, IPTG 终浓度为10mmol/L的条件下,诱导表达6h后获得最高表达量。采用割胶的方法纯化cp蛋白,纯化后的目的蛋白免疫小鼠获得了特异性抗血清。经Western blot检测,结果表明所制备的抗血清与诱导表达的重组蛋白及接种CarMV的香石竹样品均发生特异性结合。利用所制备抗血清对昆明地区的48个香石竹样品进行抽检,结果表明香石竹样品的带毒率为79.2%。本研究为大规模抗血清生产、检测应用和深入研究该病毒cp基因与寄主的互作奠定基础。     

甘蔗花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

将甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2的衣壳蛋白(coat protein,CP)基因分别克隆到原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP。将两个重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,均表达出分子量为38 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,免疫新西兰长耳兔5次,获得了SCMV-ⅠCP和SCMV-ⅣCP的多克隆抗体。间接ELISA结果表明,两种血清的效价均达到1∶8192。Western Blot结果表明,利用SCMV-ⅠCP制备的抗血清与DWK1反应更强,而利用SCMV-ⅣCP制备的抗血清与DWK2反应更强。本研究为SCMV检测及CP功能研究奠定了基础。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒山东南瓜分离物外壳蛋白基因序列分析

通过RT-PCR扩增得到了黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber Green Mottle Mosaic Virus,CGMMV）山东泰安南瓜分离物（CGMMV-TANG）的外壳蛋白基因,经过序列分析,该分离物外壳蛋白（CP）基因全长486个核苷酸,由161个氨基酸组成。对CP基因核苷酸序列进行同源性比较和构建系统进化树,并结合寄主来源及地域来源进行分析,结果表明该病毒的不同分离物在分组上与地域有一定的关系。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒研究进展

黄瓜绿斑驳花叶病毒是葫芦科上的重要病毒之一，给葫芦科作物的生产造成严重威胁。目前，国内学者对该病毒研究不多，但该病毒因其潜在的经济影响，在国外已受到高度重视，并且在进口的种子中已有截获，为促进对该病毒进行更深入的研究，对其病原生物学、分子生物学及检测防治方面的研究结果进行了综述。     

小麦黄花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的衣壳蛋白(CP)基因,将其连接原核表达载体p EHISTEV,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达38 k D的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白,免疫新西兰长耳兔,制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048,Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应,而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。     

侵染水仙的虎眼万年青花叶病毒外壳蛋白的原核表达、抗血清制备及应用

采用特异性表达引物PCR扩增了一个从英国围裙水仙样品上分离的虎眼万年青花叶病毒外壳蛋白基因序列.构建原核表达载体,制备了OrMV分离物的外壳蛋白抗血清.对制备的抗血清进行了Western-blot检测,血清学关系研究并应用于样品的间接ELISA检测.     

南芥菜花叶病毒外壳蛋白的克隆表达及抗血清的制备

依据报道的ArMV外壳蛋白基因(coat protein,cp)序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到长约990bp的ArMV cp基因亲水基团部分片段,将目的片断克隆到原核表达载体pEGX-6p-1中,构建ArMV cp基因与GST蛋白融合表达载体pEGX-cp,重组载体化大肠杆菌BL21,经IPITG诱导后,融合蛋白GST-cp得到了特异表达。用12%的SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为63.2 kDa主要以包含体的形式存在。用冰冷的KCl显色,分离表达的蛋白质特异条带制备抗体,免疫家兔后得到特异性较强的抗血清,经酶联免疫法检测效价为1∶100 000。     

甘蔗花叶病毒辅助成分-蛋白酶基因原核表达及抗血清制备

利用RT-PCR克隆甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV) DWK1分离物辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)基因,酶切后连接原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-HC-Pro。将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta,经IPTG诱导后,表达出57 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,多点注射法免疫新西兰长耳兔,制备SCMV HC-Pro抗血清。间接ELISA结果表明,该血清效价为1∶8 192。感染DWK1的玉米叶片病汁液稀释128倍时,该血清仍然能够有效检测出HC-Pro。Western-blot检测结果表明,该血清可特异性检测SCMV第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2,与同属的烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和马铃薯Y病毒(PVY)均无反应。本研究为准确、快速检测SCMV HC-Pro并进一步研究其功能和作用机制奠定了基础。     

南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆南方菜豆花叶病毒(SBMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆SBMV CP基因,将CP基因定向插入表达载体pET28a中,构建其表达载体,并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验成功克隆到大小为799 bp的SBMV CP基因,测序分析发现与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;成功构建了该基因的原核表达载体pET28a-SBMVCP,并确定重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG、4 h条件下表达量最大。[结论]该研究为SBMV抗体的制备奠定了基础。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒多克隆抗体制备及检测应用

将黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaicvirus,CGMMV)辽宁分离物繁殖在葫芦(Lagenaria siceraria)上,用葫芦作为繁殖寄主进行病毒提纯,将提纯病毒制剂免疫家兔制备多克隆抗体,抗体效价为1∶320000,建立了间接ELISA检测黄瓜绿斑驳花叶病毒方法,检测病汁液的灵敏度为1∶32000,检测提纯病毒的灵敏度为4.75×10-5mg。     

基于外壳蛋白核酸序列的中国黄瓜绿斑驳花叶病毒分离物起源分析

以直接从中国进口源性葫芦种子中提取的总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得种子上携带的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的外壳蛋白(CP)基因(LHP,Liaoning cucurbits seed protein ),将其克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.结果表明该CP基因(GenBank登陆号:DQ997778)由483个核苷酸组成,编码161个氨基酸.对包括该分离物在内的19个CP基因核苷酸序列进行同源性比较和系统进化树构建,并结合寄主来源及地域来源进行LHP的起源分析,结果表明黄瓜绿斑驳花叶病毒不同分离物的序列分群和进化关系与上述两个因素无明显关系.     

菜豆荚斑驳病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆菜豆荚斑驳病毒(BPMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆BPMV CP基因,将其连接至pMD19-T Simple载体后对阳性克隆进行测序,检测其与已知病毒外壳蛋白基因序列的同源性;将CP基因定向插入双酶切的pET30a,构建其原核表达载体并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验克隆得到的CP基因大小为1 122 bp,与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;试验成功构建了原核表达载体pET30a-BPMV CP,发现重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导4 h条件下表达量最高。[结论]该研究为BPMV抗血清的制备与液相芯片检测方法的建立奠定了基础。     

草莓镶脉病毒外壳蛋白的原核表达及多抗血清制备

PCR扩增得到了草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的外壳蛋白(coat protein,cp)基因,将SVBV cp基因克隆到原核表达载体pET-32a上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为0.05 mmol·L-1的IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳及Western-blot分析表明,SVBV cp基因在大肠杆菌中得到了融合表达。利用Ni2+-NTA亲和树脂纯化重组融合蛋白,免疫家兔获得了重组蛋白的多抗血清。以此多抗血清建立了Dot-ELISA检测方法,结果表明,制备的特异性多抗血清可以快速检测出感病草莓样品中的SVBV。     

胡葱黄条病毒外壳蛋白的原核表达与抗血清的制备

设计特异性引物PCR扩增得到胡葱黄条病毒(SYSV-O)的全长外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体pET32a-SYSV-O CP,转化大肠杆菌诱导表达。结果表明,SYSV-O CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达,分子量约为46 kDa。用纯化表达产物免疫小鼠制备抗血清,Western blot检测结果表明,抗血清与SYSV-O的CP发生了强烈的特异性反应。使用该抗血清进行了田间样品的带毒检测。     

江苏黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定

为确定从江苏省洪泽县大棚西瓜、仪征市露地瓠瓜、东台市露地南瓜上采集到3个表现为褪绿、斑驳花叶症状的病样是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)侵染,采用电子镜观察、RT-PCR和序列测定方法对其进行鉴定。电子显微镜下可见300 nm×18 nm大小的直杆状病毒粒子。根据已报道的CGMMV外壳蛋白质(cp)基因序列合成特异性引物,对所提取病样的总RNA进行RT-PCR扩增,3个分离物的RNA模板中均可扩增到大小为500 bp左右的DNA片段,测序结果表明3个分离物的片段均含有486个核苷酸,包含完整的cp基因,编码161个氨基酸。3个分离物与已报道的7个CGMMV分离物核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为91.8%～99.8%和98.1%～100.0%,与同属的其他3个病毒(Kyuri绿斑驳花叶病毒、黄瓜果实斑驳花叶病毒和小西葫芦绿斑驳花叶病毒)cp基因核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为40.7%～54.7%和44.4%～60.2%,表明所采集的3个病样由CGMMV侵染引起。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定及分子检测

【研究目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的快速鉴定检测是控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。【方法】通过汁液摩擦接种、透射电镜观察、双抗夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)和RT-PCR方法对该病毒进行鉴定;同时对RT-PCR反应体系及扩增程序进行优化,建立CGMMV免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)检测方法。【结果】血清学、生物学、电镜观察和分子生物学方法证明供试样本为黄瓜绿斑驳花叶病毒引致。IC-RT-PCR方法可以简化RNA的提取,降低对试验材料要求。【结论】IC-RT-PCR的建立为CGMMV的检测提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测方法。     

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因转化番茄的研究

通过根癌农杆菌介导，采用叶盘转化法，探讨了黄瓜花叶病毒外壳蛋白（CMV－CP）基因导入番茄栽培品种‘红宝石’的适宜条件。结果表明：适宜的卡那霉素（Km)浓度，根癌农杆菌浓度，根癌农杆菌感染时间以及共培养时间分别为35mg/L,D600约0.5,10-15min和2－3d；将诱导形成的抗性愈伤组织转接到含有35mg/L Km的分化培养基和生根培养基中使其分化不定芽和生根，获得了抗Km的番茄再生植株。对再生植株进行再欠离体培养抗Km鉴定和PCR分子检测，补CMV-C基因已导入番茄再生植株的基因组中。     

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因转化辣椒的研究

以辣椒品种'B162'为试材,探讨了通过根癌农杆菌介导法将黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV-CP)基因转化辣椒的适宜条件.结果表明,将辣椒带柄子叶进行预培养2 d后,用D600 nm为0.3的根癌农杆菌菌液浸泡7 min,再经过共培养2 d后转移到筛选分化培养基中进行培养,有利于获得辣椒抗性不定芽.通过对获得的10株抗性不定芽进行PCR检测,其中有2株扩增出目的条带,初步证明CMV-CP基因已经转入辣椒不定芽中.