甘蔗花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

将甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2的衣壳蛋白(coat protein,CP)基因分别克隆到原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP。将两个重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,均表达出分子量为38 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,免疫新西兰长耳兔5次,获得了SCMV-ⅠCP和SCMV-ⅣCP的多克隆抗体。间接ELISA结果表明,两种血清的效价均达到1∶8192。Western Blot结果表明,利用SCMV-ⅠCP制备的抗血清与DWK1反应更强,而利用SCMV-ⅣCP制备的抗血清与DWK2反应更强。本研究为SCMV检测及CP功能研究奠定了基础。     

马铃薯Y病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

采用RT-PCR方法扩增马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)衣壳蛋白(coat protein,CP)基因,将其连接到原核表达载体pEHISTEV上,获得重组质粒pEHISTEV-PVY-CP,转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达出分子量为35 k D的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,免疫新西兰大耳兔制备PVY CP抗血清。间接ELISA结果表明,该抗血清的效价为1∶16384,Western blot分析表明该抗血清只与感染PVY的普通烟植株有特异性反应,而与健康普通烟和感染PVX的普通烟植株无反应。本研究为PVY的血清学检测以及早期预警奠定了基础。     

小麦黄花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的衣壳蛋白(CP)基因,将其连接原核表达载体p EHISTEV,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达38 k D的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白,免疫新西兰长耳兔,制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048,Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应,而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。     

华南番木瓜病毒病及环斑病毒株系调查鉴定

根据田间调查、病毒粒子和内含体形态，血清反应，寄主范围和症状，昆虫介体，物理性质，潜育期等试验结果，认为华南４省区的番木瓜病毒病只有ＰＲＶ一种，根据在西葫芦上的症状特点，将ＰＲＶ初步区分为４个株系，即Ｙｓ，Ｖｂ，Ｓｍ和Ｌｃ。在３１３份标样中，它们单独所占比例分别为４０．５７％，１０．２２％，０．６４％，４．４７％Ｙｓ＋Ｖｂ（复合侵染）占４４．０８％这表明Ｙｓ为优势株系，Ｖｂ次之，Ｌｃ和Ｓｍ发生少分     

华南番木瓜病毒病及环斑病毒株系的调查鉴定

根据田间调查、病毒粒子和内含体形态、血清反应、寄主范围和症状、昆虫介体、物理性质、潜育期等试验结果、认为华南４省区的番木瓜病毒病只有ＰＲＶ一种。根据在西葫芦上的症状特点，将ＰＲＶ初步区分为４个株系，即Ｙｓ、Ｖｂ、Ｓｍ和Ｌｃ。在３１３份标样中，它们单独所占比例分别为４０．５７％，１０．２２％，０．６４％，４．４７％，Ｙｓ＋Ｖｂ（复合侵染）占４４．０８％，这表明Ｙｓ为优势株系，Ｖｂ次之，Ｌｃ和Ｓｍ发生少分布不广。研究结果还表明，以前有人报道的ＰＭａＬＶ实则是本研究的Ｖｂ，而不是一个新病毒。     

利用原核表达的衣壳蛋白制备马铃薯x病毒的抗血清

本研究构建了含马铃薯x病毒（pvx）衣壳蛋白（cp）基因的原核表达载体,利用在大肠杆菌内表达的马铃薯x病毒cp制备了效价为1∶1 600的抗血清。该血清可用于马铃薯、番茄、辣椒和烟草等作物携带pvx情况的检测。     

李属坏死环斑病毒扬州分离物CP基因的原核表达及抗血清制备

李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)严重危害蔷薇科植物,在世界范围内普遍分布。为建立快速有效的PNRSV检测方法,依据PNRSV CP基因序列设计引物,并从桃叶片上扩增PNRSV-CP片段,将双酶切产物插入原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-CP^PNRSV,转化大肠埃希菌Rosetta菌株,IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE电泳检测显示,在分子量约25 ku处有蛋白质条带,符合预期大小。镍柱亲和纯化PNRSV CP蛋白,以其纯化蛋白质免疫健康新西兰白兔,制备多克隆抗血清。Western blot、ELISA、Dot blot检测结果显示,制备的抗血清能检测到PNRSV CP基因在感病植物叶片中表达,而在健康植株中未检测到;制备的抗血清滴度稀释至1∶64 000时,仍能与纯化蛋白质发生特异性反应。综上,制备的PNRSV抗血清特异性强、效价高,可用于PNRSV的快速检测。     

番木瓜环斑病毒株系的生物学和血清学研究

本文对华南地区番木瓜环斑病毒的Ｙｓ，Ｖｂ和Ｓｍ３个株系和夏威夷ＨＡ５－１弱株系的生物学和血清学等进行了进一步的研究。确证了ＰＲＶ在华南地区至少有３个株系。在株系间亲缘关系方面，华财３个株系间的关系较密切，而与ＨＡ５－１株系的较疏远。在西葫芦植株体内增殖和运转，Ｓｍ株系病毒增殖和运转最快，在体内的浓度最高；Ｖｂ次之；Ｙｓ再次之；而ＨＡ５－１则更次之。     

番木瓜环斑病毒CP基因dsRNA原核表达载体的快速构建

重点介绍了一种快速构建dsRNA原核表达载体的方法。以番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因（PRSV-CP）3＇端-279 bp保守区段为基础,通过OZ-LIC法构建861 bp,432 bp和279 bp 3种不同长度的发卡结构,再通过XhoⅠ和ClaⅠ双酶切,将其连接到pSP73原核表达载体上,构建成PRSV-CP基因dsR...     

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

番木瓜环斑病毒（PRV）外壳蛋白（CP）基因cDNA克隆到pUC18上构型建成大肠杆菌（Escherichia coli)表达载体，Western blot检测结果表明该表达载体在E.clidDH5α中有两种特异蛋白表达，分子量为34kd的蛋白与推测的表达产物大小相符，且与PRVCP的一个“组分”大小相似；而分子量为16kd的蛋白可能是34kd蛋白的降解物或者是PRV CP基因不完全表达产物。     

番木瓜环斑病毒研究进展

综述了番木瓜病毒株系、生物学特性、检测及防治方法的最新研究进展。     

齿兰环斑病毒外壳蛋白的原核表达、抗体制备及检测应用

齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)是感染兰花的主要病毒之一.用RT-PCR方法从感染ORSV兰花中克隆到该病毒的477 bp外壳蛋白基因(CP),外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建重组原核表达载体pET-32a-CP;将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和柱纯化获得分子量约为37 ku含硫氧还蛋白的融合蛋白.以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备ORSV外壳蛋白的多克隆抗体,并用制备的多抗建立了可靠、灵敏、特异的检测ORSV的免疫捕获RT-PCR及dot-blot ELISA方法,为该兰花病毒病的诊断、兰花抗病育种和脱毒苗的建立打下了基础.     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因片段原核表达载体的构建及表达

根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达.重组蛋白经过Ni -NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34ku,并具有免疫学活性.以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1:409600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应.     

番木瓜环斑病毒的提纯研究

详细报道了影响番木瓜环斑病毒（ＰＲＶ）粗提纯效果的几个主要因素（繁殖寄主种类，有机澄清剂，分散剂，病毒浓缩前的去渣离心力，浓缩病毒的超离心力等）的最佳选择，繁殖寄主以角葫瓜最好。该研究综合上述最佳选择而拟定的一次差速离心和一次３０％蔗糖硫酸连续密度梯度离心３ｈ的简单程序较好地提供了ＰＲＶ提纯的病毒有典型核蛋白紫外吸收曲线，Ａ２６０／Ａ２８０＝１．６８，提纯产量为２．５６ｍｇ／１００ｇ西葫芦病叶，所     

番木瓜环斑病毒及其抗病策略

番木瓜环斑病毒（Papaya Ringspot Virus，PRSV）是引起番木瓜病毒病的最主要病毒，是马铃薯Y病毒组（Potyviruses）的成员之一。其为单分体正链RNA病毒，由多种蚜虫以非持久方式传播；属PRSV株系，寄主范围可划分为P型和W型两种。其中P型株系（PRSV-P）是制约生产的重要病原，除了给番木瓜生产带来严重危害，也会危害葫芦科作物。W型株系（PRSV-W，即西瓜花叶病毒一号）是危害葫芦科作物的主要病原，虽然和PRSV-P型株系血清学反应密切相关，但不侵染番木瓜。     

番木瓜环斑病毒病综合防治

结合多年的番木瓜生产种植经验和新近的国内外番木瓜环斑病毒病的防治技术,对番木瓜环斑病毒病的防治进行了综述,提出了防治番木瓜病毒病的综合策略以及"病原—寄主"平衡调控的防治思想。     

香石竹斑驳病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

 香石竹斑驳病毒（Carnation mottle virus,CarMV）是侵染香石竹的主要病毒。本研究从已鉴定的CarMV毒源植物中提取总RNA, 克隆外壳蛋白（cp）基因后构建pET30a CP重组质粒,并转入BL21（DE3）pLysS进行原核表达。通过对诱导温度、初菌浓度、IPTG的浓度等表达条件进行优化,目的蛋白在37℃, IPTG 终浓度为10mmol/L的条件下,诱导表达6h后获得最高表达量。采用割胶的方法纯化cp蛋白,纯化后的目的蛋白免疫小鼠获得了特异性抗血清。经Western blot检测,结果表明所制备的抗血清与诱导表达的重组蛋白及接种CarMV的香石竹样品均发生特异性结合。利用所制备抗血清对昆明地区的48个香石竹样品进行抽检,结果表明香石竹样品的带毒率为79.2%。本研究为大规模抗血清生产、检测应用和深入研究该病毒cp基因与寄主的互作奠定基础。     

番木瓜环斑病毒融合基因植物表达载体的构建

利用PCR重叠延伸技术（gene splicing by overlap extension,SOE）将番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）Vb株系的外壳蛋白（coat protein,CP）基因和Ys株系的复制酶（replicase protein,RP）基因构建成融合基因VY。同时对常规的SOE法进行了改进,并对改进的SOE的反应体系进行了优化,其中以Pyrobest DNA聚合酶和60℃的退火温度为最佳。将融合基因n’构建在植物表达载体pCAMBIA2300上,测序结果表明,该融合基因的序列与设计相符。融合基因VY植物表达载体的构建,可为进一步获得对PRSV广谱抗性的转基因番木瓜奠定基础。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒外壳蛋白基因原核表达及抗血清制备

将黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV上获得pEHISTEV-CGMMV-CP,转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,表达出分子量为19.5 kD的CGMMV CP融合蛋白。切胶回收诱导表达的CGMMV CP免疫家兔,制备抗血清。Western Blotting检测发现,制备的抗血清能与CGMMV CP发生特异性免疫反应,与同属的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)无反应。琼脂双扩散试验测定,制备抗血清的效价为1∶16,ELISA测定效价为1∶1024。该血清特异性强、效价高,可用于CGMMV的检测。